血小板聚集初期形狀變化與聚集的關系及其影響因素分析

毛亞麗，韓紀舉，王 云，常 歡，夏作理，趙曉民

(泰山醫學院，山東泰安271000)

一般情況下，致聚劑會使血小板從靜息狀態的圓盤狀變為球形(或帶有偽足)，這種聚集初期的形狀改變(變形)可導致GPⅡb/Ⅲa活化，引發聚集，因而變形是一種血小板活化的表現［1～3］。應用光學法血小板聚集儀檢測時，聚集初期的變形表現為起始透光度降低［4～6］。由于聚集初期變形發生較快，該法比應用顯微鏡能更快、更準確地觀察到變形。但在聚集初期血小板變形受哪些因素影響，以及與聚集的關系，少有研究。2013年5月～2014年1月，我們以起始透光度降低作為血小板聚集初期變形的指標，觀察了動物和人、血小板體系、致聚劑對血小板變形的影響，分析聚集與變形之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象 SPF級雄性SD大鼠，體質量240～260 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司;SPF級雄性昆明種小鼠，體質量18～29 g，由山東泰邦生物制品有限公司提供;健康成年男性，20～45歲，采血前2周均未服用任何藥物。

1.1.2 主要儀器和試劑 720-2型血小板聚集儀購于美國Chrono-log公司，3K30型離心機購于美國Sigma公司，PE-6800VET型全自動血細胞分析儀購于深圳市普康電子有限公司;戊巴比妥鈉購于Merck公司，二磷酸腺苷(ADP)、膠原購于美國Chronolog公司，纖維蛋白原(FIB)、三磷酸腺苷雙磷酸酶(APY)和前列腺素E1(PGE1)購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)制備 小鼠和大鼠以腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，開胸心臟取血，肝素抗凝(40 000 U/L)，1 000 r/min 離心10 min，上清為 PRP;剩余部分以3 000 r/min離心10 min，上清為PPP。用21 G采血針于人肘正中靜脈取血30 mL，ACD(2%葡萄糖、2.5%檸檬酸鈉、1.35%檸檬酸)抗凝。1 100 r/min離心10 min，上清為PRP，PPP制備同上。

1.2.2 洗滌血小板制備［7，8］人 PRP中加肝素、APY、PGE1，2 200 r/min 離心10 min，分別用不同緩沖液洗滌血小板3次。首次為Tyrode液中加入肝素、APY、PGE1，第2次緩沖液中減肝素，第3次緩沖液僅用PGE1，最后將血小板懸浮于Tyrode液。

1.2.3 血小板聚集測定 血小板計數均調整為200×109/mL，溫度37℃，攪拌子轉速1 200 r/min，應用血小板聚集儀記錄5～10 min聚集曲線，檢測最大聚集率(%)。

1.2.3.1 人和小鼠、大鼠PRP的血小板聚集檢測［9，10］以生理鹽水(NS)調整PRP血小板數，同倍稀釋 PPP作為聚集對照，加入 ADP(2.5×10-3mmol/L)5～10 μL檢測。實驗中2～3只小鼠PRP混合后測定。

1.2.3.2 人的兩種PRP血小板體系聚集檢測 取人PPP 17份，同一樣本分2份，分別用PPP、NS稀釋調整PRP血小板數，加入膠原(1×10-3g/L)5～10 μL 檢測。

1.2.3.3 ADP和膠原在人兩種血小板體系的聚集檢測 實驗分PRP組(用NS調整PRP血小板數)、洗滌血小板組(以Tyrode液調整血小板數)，同一個體(n=8)PRP要分別進入2組，并應用ADP(5×10-3mmol/L)5～10 μL和膠原(1×10-3g/L)5～10 μL檢測。洗滌血小板聚集前(以Tyrode液調整血小板數后)加入FIB(0.1 g/L)5 μL。

1.2.4 血小板聚集初期變形測定［4～6，11］分組同聚集測定，根據聚集曲線，測定最大負值(加入致聚劑后出現的最大負值)、達最大負值時間(加入致聚劑后至出現最大負值的時間)。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。數據以±s表示，兩組比較用t檢驗或非參數檢驗方法;用Pearson相關和多元線性回歸法，分析聚集率與變形指標之間的關系。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人和大鼠、小鼠血小板聚集率及聚集初期變形的比較 見表1。

表1 人和大鼠、小鼠血小板聚集率及聚集初期變形的比較(±s)

表1 人和大鼠、小鼠血小板聚集率及聚集初期變形的比較(±s)

注:與小鼠比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與大鼠比較，△P ＜0.01

種屬類型 n 聚集率(%)最大負值(-%)達最大負值時間(s)8 21.8±10.6 2.8±1.0 1.5±0.6大鼠 9 22.6± 5.8 3.4±0.8 11.4±4.7*人 9 23.6± 4.6 11.3±2.6#△ 7.3±4.0小鼠*

2.2 不同稀釋PRP方法對血小板聚集率及聚集初期變形的影響 見表2。

表2 不同稀釋PRP方法對血小板聚集率及聚集初期變形的影響(±s)

表2 不同稀釋PRP方法對血小板聚集率及聚集初期變形的影響(±s)

注:與PPP稀釋方法比較，*P＜0.05

稀釋方法 n 聚集率(%)最大負值(-%)達最大負值時間(s)PPP 17 48.2±12.9 10.0±2.4 50.1±17.0 NS 17 52.0±15.8 8.4±1.7* 67.4±27.9*

2.3 ADP和膠原對血小板聚集率及聚集初期變形的影響 見表3。

2.4 聚集率與血小板聚集初期變形指標的關系將所有聚集實驗作為一個整體(n=92)，相關分析顯示，聚集率與最大負值、達最大負值時間呈正相關(r分別為0.49、0.48，P 均 ＜0.01)。

表3 ADP和膠原誘導血小板聚集初期變形的比較(±s)

表3 ADP和膠原誘導血小板聚集初期變形的比較(±s)

注:與ADP下同一底物比較，*P＜0.05，#P＜0.01;與同一致聚劑下PRP比較，△P＜0.05，○P＜0.01

致聚劑 n 聚集率(%)最大負值(-%)達最大負值時間(s)ADP PRP 8 24.4±4.1 11.0±2.7 7.5±4.2洗滌血小板 8 22.6±3.2 1.3±0.5○ 4.2±1.6△膠原PRP 8 21.3±5.7 7.0±3.9* 17.3±4.4#洗滌血小板 8 24.0±9.5 2.3±0.6#△ 49.5±16.1#△

3 討論

研究變形可應用EGTA抗凝，使血小板只出現變形而不聚集來開展［6，12］;但這種方法將變形和聚集分割開來研究，不能反映聚集過程中變形的改變以及對聚集的影響，因而研究聚集初期血小板變形對理解聚集更有意義。

本研究結果顯示，聚集率與變形指標均正相關，表明血小板變形增加可使聚集增強。其中最大負值對聚集率影響最大，達最大負值時間較弱。為了在聚集過程中研究血小板的變形情況，本實驗組間的聚集率保持基本相同。本研究觀察了不同實驗對象的血小板變形，結果顯示人、大鼠、小鼠之間最大負值和(或)達最大負值時間有統計學意義，表明變形能力有種屬差異;應用EGTA抗凝研究也表明，人和小鼠血小板變形不同。其中，人的最大負值是大鼠和小鼠的3～4倍，提示人比大鼠和小鼠血小板變形能力要強。因此，相關研究要注意實驗對象之間血小板變形的差別。PPP和NS稀釋PRP是聚集試驗常用調整血小板濃度的方式，PPP稀釋的血小板與體內環境基本相同。本研究結果顯示，NS稀釋后最大負值減小，達到最大負值的時間延長。表明NS稀釋的血小板變形比PPP稀釋的弱，提示血漿膠體滲透壓成分對血小板變形有促進作用。洗滌血小板體系除血小板外，其組成為電解質和牛血清白蛋白。本研究結果顯示，與PRP比較，應用ADP或膠原后，洗滌血小板變形均減弱。再次表明不同血小板體系影響變形，并提示血漿電解質和白蛋白不是影響變形的主要因素。此外，本研究結果顯示，應用膠原后，在PRP中最大負值比應用ADP減小，達最大負值時間增大;在洗滌血小板中，最大負值、達最大負值時間比ADP均增大，表明在PRP中，ADP所致血小板變形能力強;在洗滌血小板重，膠原所致者強。提示不同致聚劑在不同血小板體系，導致血小板變形能力不同。同時還觀察到，無論應用ADP或膠原，洗滌血小板比PRP血小板變形均減弱，再次提示血漿膠體滲透壓成分對血小板變形的促進作用。

總之，血小板聚集初期變形促進聚集，人的比大鼠、小鼠增強，NS稀釋PRP和洗滌血小板減弱，在PRP中ADP所致血小板變形能力強，在洗滌血小板中膠原所致者強。這對于研究血小板變形中選取實驗對象、血小板體系和致聚劑以及相關結果分析提供了實驗依據，也為從血小板體系中尋找影響變形的因素提供了參考，并為從血小板變形來調控聚集提供了思路。但其他致聚劑對變形的影響、相關干預藥物的篩選以及有關信號通路的變化，還需進一步研究。

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