原代豬成纖維細胞電轉染條件的探索

劉西梅+華再東+張立蘋+肖紅衛+李莉+任紅艷+畢延震

摘要：用綠色熒光蛋白基因的DNA（pEGFP-N1）作為目的基因，對原代豬成纖維細胞電轉染條件進行探索。結果表明，在電壓1 200 V/cm、脈沖時間3 ms、pEGFP-N1添加量4 mg/mL時電轉染效率最好。

關鍵詞：豬；綠色熒光蛋白基因的DNA（pEGFP-N1）；原代成纖維細胞；電轉染

中圖分類號：S813.3；S828 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）19-4647-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.037

Electroporation Parameters of Primary Swine Fibroblasts

LIU Xi-mei， HUA Zai-dong， ZHANG Li-ping， XIAO Hong-wei， LI Li， REN Hong-yan， BI Yan-zhen

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Hubei Academy of Agricultural Science， Hubei Key Lab of Animal Embryo

and Molecular Breeding，Wuhan 430064，China）

Abstract： The electroporation conditions of primary porcine fibroblasts were studied using the EGFP-N1 genes as target gene. The results showed that the transfection efficiency was the best when 4 mg/mL pEGFP-N1 was added and it was pulsed 3 ms under 1 200 V/cm voltage.

Key words：swine； pEGFP-N1； primary fibroblast； electroporation

開展轉基因克隆豬研究不僅對畜牧業具有重大的推動作用，而且能為人類醫學和生物學研究提供理想的動物模型，其研究和應用的第一關就是體細胞的轉基因。細胞轉基因的方法很多，如病毒載體法、顯微注射法、微粒子轟擊法、磷酸鈣共沉淀法、脂質體法、DEAE-葡聚糖法、電穿孔法（也稱電擊法、電轉染）等，在這些方法中，以操作簡單、毒性低、效率高等特點而被普遍采用的方法之一當屬電穿孔法[1，2]。該方法是20世紀80年代初期發展起來的，主要用于將DNA導入多種傳代細胞，理論上可以轉染幾乎所有類型不同狀態的細胞，而原代細胞的轉染是近年發展起來的[3，4]。對原代細胞轉基因能有效地降低轉基因細胞代次，從而提高體細胞克隆的效率，這對于克隆轉基因豬顯得尤為重要。豬胎兒成纖維細胞是轉基因克隆豬生產中的常用細胞系，目前普遍存在轉染效率低下的問題，只能通過長期藥物篩選來富集陽性細胞，而長期藥物篩選往往會影響細胞生理特性，增加細胞的傳遞次數，對后續試驗產生不利影響，因而迫切需要一種高效的轉染方法[5]。本試驗采用原代豬成纖維細胞探索不同的電轉染條件，篩選出最為優化的方案，以提高原代細胞的轉染效率，從而間接提高了轉基因克隆豬的總效率。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及儀器

綠色熒光蛋白基因的DNA（pEGFP-N1）質粒為湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所生物技術實驗室保存；雙抗（10萬 U/mL青霉素和100萬 U/mL鏈霉素）、FBS（胎牛血清）、DMEM培養基（杜爾貝科改良Eagles 培養基）、PBS（杜爾貝科磷酸緩沖液）、胰蛋白酶、質粒提取試劑盒均購自Gibco公司；電穿孔液購自Eppendorf公司。

電穿孔儀BTX2000及電穿孔杯購自BTX公司，熒光顯微鏡為Leica。

1.2 轉染質粒pEGFP—N1的提取

將pEGFP-N1質粒轉化入大腸桿菌DH 5α，挑取單克隆細菌于滅菌 LB培養液培養擴增，用天根生化科技（北京）有限公司試劑盒提取質粒pEGFP-N1，測定其濃度后，-20 ℃保存，電轉染備用。

1.3 豬胎兒成纖維細胞培養

無菌條件下取35日齡胎豬（湖北白豬），用含雙抗的PBS沖洗2～3次，取上皮組織，以含雙抗的PBS清洗1次，再用含雙抗的DMEM培養基清洗1次，剪成小于1 mm3的組織塊，將組織一塊塊種植在6孔的細胞板內，4 h后每孔加1.8 mL DMEM培養基和0.2 mL FBS再放入培養箱，39 ℃、0.5%CO2、飽和濕度環境下培養。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，3～4 d換一次培養基[5]。待細胞生長到80%左右消化后用于電轉染。

1.4 電轉染細胞制備

細胞生長到80%左右后，去除培養基，先用PBS液清洗1～2次，再用0.25%胰蛋白酶消化細胞，顯微鏡下觀察，待細胞間隙出現時去除胰酶，加含10%FBS的DMEM培養基終止消化，輕輕吹打懸浮細胞，離心，再用PBS液洗滌，離心后沉淀細胞加電穿孔液，稀釋調整細胞密度為1×105 Ce//s/mL[2，6]，取100 μL于2 mm電轉染杯中在不同條件參數下進行電轉染。于24 h和48 h在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.5 熒光顯微鏡下觀察 pEGFP—N1的表達

在倒置熒光顯微鏡下觀察時，根據熒光強度和熒光細胞的比例計數。同一個視野先計數在藍光激發下發出綠色熒光的細胞，然后于可見光下計數該視野的細胞總數。電轉染率=發出綠色熒光細胞數/細胞總數×100%。每孔隨機統計6個視野[2]。

1.6 試驗設計

1）不同電壓對電轉染效果的影響。在準備好的電轉染細胞中按4 mg/mL 添加pEGFP-N1，固定電脈沖時間為3 ms，分別在800、1 000、1 200、1 400 V/cm 4個電壓條件下電轉染，再分別于24、48 h在熒光顯微鏡下觀察計數，以探索最佳電壓參數。

2）不同脈沖時間對電轉染效果的影響。在準備好的電轉染細胞中按4 mg/mL添加pEGFP-N1，固定電壓為1 200 V，在2、3、4、5 ms 4個脈沖時間進行電轉染，分別于24、48 h在熒光顯微鏡下觀察計數，以確定最適的脈沖時間。

3）不同濃度的pEGFP-N1對電轉染效果的影響。在準備好的電轉染細胞中分別按2、3、4、5 mg/mL添加pEGFP-N1，固定電壓為1 200 V， 電脈沖時間為3 ms進行電轉染，再分別于電轉染后的24、48 h在熒光顯微鏡下觀察計數，以確定最適的pEGFP-N1濃度。

以上每種試驗均重復3次，結果取平均值。試驗數據經X2統計處理，進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 電壓對電轉染效果的影響

由表1可見，24 h和48 h觀察結果均以800 V/cm處理的電轉染率最低，1 200 V/cm處理的電轉染率最高，兩者差異極顯著（P<0.01）；24 h時，1 000 V/cm處理與1 200、1 400 V/cm處理間差異顯著（P<0.05），1 200 V/cm處理與1 400 V/cm處理間差異不顯著（P>0.05）；48 h時，1 200 V/cm處理與1 000、1 400 V/cm處理間差異顯著（P<0.05），1 000 V/cm處理與1 400 V/cm處理間差異不顯著（P>0.05）。可見不同電壓的電轉染效果差別較大，以1 200 V/cm處理的電轉染率效果最好。

2.2 脈沖時間對電轉染效果的影響

由表2可見，24 h時，脈沖時間為5 ms時其電轉染率顯著（P<0.05）低于其他3組，其他3組間差異不顯著，可能由于5 ms電脈沖時間長細胞死亡比較多，電轉染率反而降低；而48 h時，脈沖時間為2、3 ms組的電轉染率顯著（P<0.05）高于脈沖時間4、5 ms組，說明電擊時間對瞬時轉染效果影響明顯，最適脈沖時間以3 ms為宜。

2.3 pEGFP—N1濃度對電轉染效果的影響

由表3可見，在24和48 h時，pEGFP-N1均以4 mg/mL添加時其轉染效率最高，以2 mg/mL添加時其轉染效率最低，兩者之間差異極顯著（P<0.01）；48 h觀察，pEGFP-N1濃度為3、4、5 mg/mL時，其電轉染率間差異均不顯著，說明pEGFP-N1濃度達到一定值，對總體轉染效率的影響較小。綜合分析后認為pEGFP-N1添加量以4 mg/mL為宜。

3 小結與討論

本試驗結果表明，用pEGFP-N1作為目的基因，對原代豬成纖維細胞電轉染的最佳條件為：電壓1 200 V/cm，脈沖時間3 ms，pEGFP-N1添加量為4 mg/mL。

體細胞克隆體系所用的供體細胞代次越低越有利于克隆，然而體細胞建系、保存、復蘇、轉基因、篩選等過程都在增加細胞的代數，而細胞代數越高越不利于克隆；如果能在原代細胞中進行轉基因，將使轉基因克隆的供體細胞代次大幅度降低，從而提高克隆效率[2]。從本試驗的結果看，這一方案是可行的。原代細胞為混雜細胞又比較脆弱、不穩定，故轉染條件無法沿用純化建系的細胞，本試驗中，在800～1 400 V/cm電壓間處理，隨著電壓升高，轉染率也隨之提高，在1 200 V/cm時達到最高值，之后電壓升高，轉染率反而降低，這與純化細胞系有所不同[5]。而電轉染脈沖時間在2～5 ms間，出現短時間電擊效率高、長時間電擊效率低的現象，即2～3 ms時電轉染效率高，4～5 ms時電轉染效率低，這一結果有別于季索菲[2]、張慶曉等[5]、谷瑞環等[6]的電轉染數據，其原因可能是原代細胞太脆弱，難以承受長時間的電擊[7]。不過pEGFP-N1濃度似乎對原代細胞的電轉染率影響較小，當其濃度達到一定值后，其電轉染率間無顯著差異，這一點與傳代的細胞系相似[1，7]。從試驗結果和上述分析不難發現，原代細胞可以轉基因，只是電轉染參數有別于傳代的細胞系。原代細胞電轉染基因后，若細胞篩選、單克隆挑選、陽性細胞擴繁等與細胞純化過程同時進行的，可以使供體細胞減少2～5個代次和1次冷凍過程，從而起到提高轉基因體細胞克隆效率的作用。

參考文獻：

[1] 錢 鋒，肖成組.電擊緩沖液對哺乳動物細胞電穿孔效率的影響[J].軍事醫學科學院院刊，1999，23（2）：101-103.

[2] 季索菲.豬成纖維細胞脂質體或電穿孔轉染pEGFP-N1條件的優化[J].合肥：安徽農業大學，2011.

[3] 朱劍鋒，張廣森，龔凡杰，等.電穿孔法基因轉染K562細胞條件的優化[J].實用臨床醫藥雜志，2008，12（5）：43-45.

[4] 宋永利，陸 昕，邱 爽，等.巨噬細胞RAW264.7的培養及電轉染條件的優化[J].西北農業學報，2010，19（9）：21-24.

[5] 張慶曉，王慧利，孟春花，等.電穿孔法轉染豬胎兒成纖維細胞條件優化[J].江蘇農業科學，2012，40（12）：202-204.

[6] 谷瑞環，李善剛，宋偉杰，等.電穿孔介導外源基因轉染兔成體成纖維細胞的初步研究[J].實驗動物與比較醫學，2010，30（4）：241-245.

[7] 徐 峰，呂 楊，謝院生，等.原代大鼠腎小球系膜細胞最佳電轉染條件的探索和驗證[J].軍需進修學院學報，2010，31（5）：459-461.

1.6 試驗設計

1）不同電壓對電轉染效果的影響。在準備好的電轉染細胞中按4 mg/mL 添加pEGFP-N1，固定電脈沖時間為3 ms，分別在800、1 000、1 200、1 400 V/cm 4個電壓條件下電轉染，再分別于24、48 h在熒光顯微鏡下觀察計數，以探索最佳電壓參數。

2）不同脈沖時間對電轉染效果的影響。在準備好的電轉染細胞中按4 mg/mL添加pEGFP-N1，固定電壓為1 200 V，在2、3、4、5 ms 4個脈沖時間進行電轉染，分別于24、48 h在熒光顯微鏡下觀察計數，以確定最適的脈沖時間。

3）不同濃度的pEGFP-N1對電轉染效果的影響。在準備好的電轉染細胞中分別按2、3、4、5 mg/mL添加pEGFP-N1，固定電壓為1 200 V， 電脈沖時間為3 ms進行電轉染，再分別于電轉染后的24、48 h在熒光顯微鏡下觀察計數，以確定最適的pEGFP-N1濃度。

以上每種試驗均重復3次，結果取平均值。試驗數據經X2統計處理，進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 電壓對電轉染效果的影響

由表1可見，24 h和48 h觀察結果均以800 V/cm處理的電轉染率最低，1 200 V/cm處理的電轉染率最高，兩者差異極顯著（P<0.01）；24 h時，1 000 V/cm處理與1 200、1 400 V/cm處理間差異顯著（P<0.05），1 200 V/cm處理與1 400 V/cm處理間差異不顯著（P>0.05）；48 h時，1 200 V/cm處理與1 000、1 400 V/cm處理間差異顯著（P<0.05），1 000 V/cm處理與1 400 V/cm處理間差異不顯著（P>0.05）。可見不同電壓的電轉染效果差別較大，以1 200 V/cm處理的電轉染率效果最好。

2.2 脈沖時間對電轉染效果的影響

由表2可見，24 h時，脈沖時間為5 ms時其電轉染率顯著（P<0.05）低于其他3組，其他3組間差異不顯著，可能由于5 ms電脈沖時間長細胞死亡比較多，電轉染率反而降低；而48 h時，脈沖時間為2、3 ms組的電轉染率顯著（P<0.05）高于脈沖時間4、5 ms組，說明電擊時間對瞬時轉染效果影響明顯，最適脈沖時間以3 ms為宜。

2.3 pEGFP—N1濃度對電轉染效果的影響

由表3可見，在24和48 h時，pEGFP-N1均以4 mg/mL添加時其轉染效率最高，以2 mg/mL添加時其轉染效率最低，兩者之間差異極顯著（P<0.01）；48 h觀察，pEGFP-N1濃度為3、4、5 mg/mL時，其電轉染率間差異均不顯著，說明pEGFP-N1濃度達到一定值，對總體轉染效率的影響較小。綜合分析后認為pEGFP-N1添加量以4 mg/mL為宜。

3 小結與討論

本試驗結果表明，用pEGFP-N1作為目的基因，對原代豬成纖維細胞電轉染的最佳條件為：電壓1 200 V/cm，脈沖時間3 ms，pEGFP-N1添加量為4 mg/mL。

體細胞克隆體系所用的供體細胞代次越低越有利于克隆，然而體細胞建系、保存、復蘇、轉基因、篩選等過程都在增加細胞的代數，而細胞代數越高越不利于克隆；如果能在原代細胞中進行轉基因，將使轉基因克隆的供體細胞代次大幅度降低，從而提高克隆效率[2]。從本試驗的結果看，這一方案是可行的。原代細胞為混雜細胞又比較脆弱、不穩定，故轉染條件無法沿用純化建系的細胞，本試驗中，在800～1 400 V/cm電壓間處理，隨著電壓升高，轉染率也隨之提高，在1 200 V/cm時達到最高值，之后電壓升高，轉染率反而降低，這與純化細胞系有所不同[5]。而電轉染脈沖時間在2～5 ms間，出現短時間電擊效率高、長時間電擊效率低的現象，即2～3 ms時電轉染效率高，4～5 ms時電轉染效率低，這一結果有別于季索菲[2]、張慶曉等[5]、谷瑞環等[6]的電轉染數據，其原因可能是原代細胞太脆弱，難以承受長時間的電擊[7]。不過pEGFP-N1濃度似乎對原代細胞的電轉染率影響較小，當其濃度達到一定值后，其電轉染率間無顯著差異，這一點與傳代的細胞系相似[1，7]。從試驗結果和上述分析不難發現，原代細胞可以轉基因，只是電轉染參數有別于傳代的細胞系。原代細胞電轉染基因后，若細胞篩選、單克隆挑選、陽性細胞擴繁等與細胞純化過程同時進行的，可以使供體細胞減少2～5個代次和1次冷凍過程，從而起到提高轉基因體細胞克隆效率的作用。

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[5] 張慶曉，王慧利，孟春花，等.電穿孔法轉染豬胎兒成纖維細胞條件優化[J].江蘇農業科學，2012，40（12）：202-204.

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[7] 徐 峰，呂 楊，謝院生，等.原代大鼠腎小球系膜細胞最佳電轉染條件的探索和驗證[J].軍需進修學院學報，2010，31（5）：459-461.

1.6 試驗設計

1）不同電壓對電轉染效果的影響。在準備好的電轉染細胞中按4 mg/mL 添加pEGFP-N1，固定電脈沖時間為3 ms，分別在800、1 000、1 200、1 400 V/cm 4個電壓條件下電轉染，再分別于24、48 h在熒光顯微鏡下觀察計數，以探索最佳電壓參數。

2）不同脈沖時間對電轉染效果的影響。在準備好的電轉染細胞中按4 mg/mL添加pEGFP-N1，固定電壓為1 200 V，在2、3、4、5 ms 4個脈沖時間進行電轉染，分別于24、48 h在熒光顯微鏡下觀察計數，以確定最適的脈沖時間。

3）不同濃度的pEGFP-N1對電轉染效果的影響。在準備好的電轉染細胞中分別按2、3、4、5 mg/mL添加pEGFP-N1，固定電壓為1 200 V， 電脈沖時間為3 ms進行電轉染，再分別于電轉染后的24、48 h在熒光顯微鏡下觀察計數，以確定最適的pEGFP-N1濃度。

以上每種試驗均重復3次，結果取平均值。試驗數據經X2統計處理，進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 電壓對電轉染效果的影響

由表1可見，24 h和48 h觀察結果均以800 V/cm處理的電轉染率最低，1 200 V/cm處理的電轉染率最高，兩者差異極顯著（P<0.01）；24 h時，1 000 V/cm處理與1 200、1 400 V/cm處理間差異顯著（P<0.05），1 200 V/cm處理與1 400 V/cm處理間差異不顯著（P>0.05）；48 h時，1 200 V/cm處理與1 000、1 400 V/cm處理間差異顯著（P<0.05），1 000 V/cm處理與1 400 V/cm處理間差異不顯著（P>0.05）。可見不同電壓的電轉染效果差別較大，以1 200 V/cm處理的電轉染率效果最好。

2.2 脈沖時間對電轉染效果的影響

由表2可見，24 h時，脈沖時間為5 ms時其電轉染率顯著（P<0.05）低于其他3組，其他3組間差異不顯著，可能由于5 ms電脈沖時間長細胞死亡比較多，電轉染率反而降低；而48 h時，脈沖時間為2、3 ms組的電轉染率顯著（P<0.05）高于脈沖時間4、5 ms組，說明電擊時間對瞬時轉染效果影響明顯，最適脈沖時間以3 ms為宜。

2.3 pEGFP—N1濃度對電轉染效果的影響

由表3可見，在24和48 h時，pEGFP-N1均以4 mg/mL添加時其轉染效率最高，以2 mg/mL添加時其轉染效率最低，兩者之間差異極顯著（P<0.01）；48 h觀察，pEGFP-N1濃度為3、4、5 mg/mL時，其電轉染率間差異均不顯著，說明pEGFP-N1濃度達到一定值，對總體轉染效率的影響較小。綜合分析后認為pEGFP-N1添加量以4 mg/mL為宜。

3 小結與討論

本試驗結果表明，用pEGFP-N1作為目的基因，對原代豬成纖維細胞電轉染的最佳條件為：電壓1 200 V/cm，脈沖時間3 ms，pEGFP-N1添加量為4 mg/mL。

體細胞克隆體系所用的供體細胞代次越低越有利于克隆，然而體細胞建系、保存、復蘇、轉基因、篩選等過程都在增加細胞的代數，而細胞代數越高越不利于克隆；如果能在原代細胞中進行轉基因，將使轉基因克隆的供體細胞代次大幅度降低，從而提高克隆效率[2]。從本試驗的結果看，這一方案是可行的。原代細胞為混雜細胞又比較脆弱、不穩定，故轉染條件無法沿用純化建系的細胞，本試驗中，在800～1 400 V/cm電壓間處理，隨著電壓升高，轉染率也隨之提高，在1 200 V/cm時達到最高值，之后電壓升高，轉染率反而降低，這與純化細胞系有所不同[5]。而電轉染脈沖時間在2～5 ms間，出現短時間電擊效率高、長時間電擊效率低的現象，即2～3 ms時電轉染效率高，4～5 ms時電轉染效率低，這一結果有別于季索菲[2]、張慶曉等[5]、谷瑞環等[6]的電轉染數據，其原因可能是原代細胞太脆弱，難以承受長時間的電擊[7]。不過pEGFP-N1濃度似乎對原代細胞的電轉染率影響較小，當其濃度達到一定值后，其電轉染率間無顯著差異，這一點與傳代的細胞系相似[1，7]。從試驗結果和上述分析不難發現，原代細胞可以轉基因，只是電轉染參數有別于傳代的細胞系。原代細胞電轉染基因后，若細胞篩選、單克隆挑選、陽性細胞擴繁等與細胞純化過程同時進行的，可以使供體細胞減少2～5個代次和1次冷凍過程，從而起到提高轉基因體細胞克隆效率的作用。

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[1] 錢 鋒，肖成組.電擊緩沖液對哺乳動物細胞電穿孔效率的影響[J].軍事醫學科學院院刊，1999，23（2）：101-103.

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[7] 徐 峰，呂 楊，謝院生，等.原代大鼠腎小球系膜細胞最佳電轉染條件的探索和驗證[J].軍需進修學院學報，2010，31（5）：459-461.