熱激處理對甜柿外植體活性氧代謝的影響

楊谷良+鄧先珍+范媛媛

摘要：以寶華甜柿（Diospyros kaki c.v.‘Baohuatianshi）為材料，在對試驗材料進行熱激處理后，檢測了活性氧代謝相關生理指標的變化情況。結果表明，經過熱激處理后，與對照相比，外植體內超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活力出現了提高，丙二醛（MDA）和過氧化氫（H2O2）的含量則有所降低。說明熱激處理能夠降低活性氧含量，保護了細胞膜結構的完整性，抑制了褐變發生。

關鍵詞：甜柿（Diospyros kaki Thunb）；組織培養；熱激處理；活性氧；保護酶

中圖分類號：S665.2；Q945.79 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）19-4619-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.029

Effects of Heat Shock on Active Oxygen Metabolism

of Diospyros kaki Thunb Explants

YANG Gu-liang1，2， DENG Xian-zhen1，3， FAN Yuan-yuan1，2

（1. Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization， Huanggang 438000， Hubei， China； 2. College of Life Science， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， Hubei， China；

3. Hubei Academy of Forestry Sciences， Wuhan 430075， China）

Abstract： The leaf of “Baohuatianshi” was treated under 45 ℃ for 30 min and the parameters of active oxygen metabolism-related physiological indeexes were investigated. Results showed that compared with the control， the activity of superoxide dismutase（SOD） and scavenger enzymes（CAT） could be improved in a short period after the heat shock treatment， and then the content of malondialdehyde（MDA） and hydrogen （H2O2） reduced. It is indicated that the content of active oxygen was reduced by the heat shock treatment， thus the cell membranes stability was protected and the heat shock treatment could effectively suppress tissue culture browning in persimmon.

Key words： Diospyros kaki Thunb； tissue culture； heat shock treatment； reactive oxygen species； protective enzyme

柿（Diospyros kaki L.f）是柿科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros）一種廣泛栽培的果樹。中國已有2 000多年柿樹種植歷史，是世界上柿樹栽培最早的國家[1]。寶華甜柿（Diospyros kaki c.v.‘Baohuatianshi）是湖北省羅田縣的一個地方品種，于2001年通過了湖北省林木良種審定委員會審定，是我國選育成功的第一個完全甜柿新品種，寶華甜柿不經過脫澀處理就可以食用，果品貯藏時間比澀柿長，具有廣闊的發展前景[2]。

甜柿組織培養過程中容易出現褐化，據張妙霞等[3]報道，在甜柿組織培養的過程中，褐變率最高達到90%，嚴重影響了組織培養的增殖率和成活率。多數學者認為，對植物適度熱激處理可以降低總酚含量，從而減輕組織褐變的程度[4，5]。為此以羅田地方品種寶華甜柿葉片為試驗材料，接種在培養基MS（1/2N）+ 2.0 mg/L ZT（玉米素） + 0.1 mg/L TDZ（噻苯?。┻M行培養，通過比較對照組與熱激處理組葉片外植體組織培養褐變程度，分析了熱激處理對酚類物質代謝的影響，初步揭示了熱激處理抑制甜柿組織培養褐變的生理機制，以期為熱激處理應用于生產實踐提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

選取無菌條件下培養的沒有褐變的寶華甜柿為試驗材料，在45 ℃條件下，將帶有葉片的植株熱激處理30 min后，正常條件下培養24 h[（培養溫度25 ℃，光照度40 μmol/（m2·s）]，然后選取成熟度基本一致的葉片剪成1.0 cm2大小的外植體，每瓶內接種3個外植體，外植體培養的培養基組成為：MS（1/2 N）+2.0 mg /L ZT + 0.1 mg/L TDZ。同時，以沒有經過熱激處理的葉片作為外植體接種在相同的培養基組成上作為對照。對照與處理各接種50 瓶，均放入智能光照培養箱中培養，培養溫度25 ℃，光照度40 μmol/（m2·s），每天光照時間12 h。在接種后第0、6、12、18、24天，每次各隨機取出4瓶用于生理指標測定，每個指標3次重復。

1.2 測定方法

參照Heath等[6]的方法測定丙二醛（MDA）的含量，參照Yang等[7]的方法測定過氧化氫（H2O2）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性。

2 結果與分析

2.1 熱激處理對寶華甜柿外植體MDA含量的影響

從圖1可以看出，在培養的前6 d，處理組和對照MDA含量差異不明顯。從第6天開始，處理組的MDA 含量與對照有較大差異，其中第18天時二者差異最大，差異達到8.03 nmol/g，比對照低66.9%。MDA是膜脂過氧化產物之一，MDA含量越高，植株受到的傷害就越嚴重。熱激處理后MDA含量降低，表明在培養過程中，熱激處理保護了外植體細胞膜的完整性。

2.2 熱激處理對寶華甜柿外植體H2O2含量的影響

圖2顯示的是熱激處理后寶華甜柿外植體中H2O2含量的變化情況。從圖2中可以看出，處理組和對照H2O2含量的變化趨勢與MDA基本一致，也是在6 d時差距不明顯，6 d以后，對照H2O2含量明顯高于處理組。其中培養到第18天時，處理組的外植體中H2O2含量比對照組降低了30%。

2.3 熱激處理對寶華甜柿外植體SOD活性的影響

對比對照組與處理組寶華甜柿葉片外植體的SOD 活性變化趨勢，兩者均在第6天后開始有比較明顯的下降（圖3），從第12天以后維持在一個相對較低的水平。與對照相比，處理組的SOD活性在第6天高于對照，第12、18、24天分別比對照低50%、56.3%、50%。

2.4 熱激處理對寶華甜柿外植體CAT活性的影響

CAT能清除植株內產生的H2O2，從而使H2O2控制在較低水平。在整個檢測過程中，對照與熱激處理組的CAT活性變化趨勢基本一致，在第6～18天均有明顯增加，以后維持在一個穩定水平（圖4）。

2.5 相關分析

從表1可以看出，H2O2與MDA、SOD、CAT的相關系數分別為0.915 1、-0.909 6、0.976 8，與MDA和CAT呈正相關，而與SOD呈負相關性。

3 小結與討論

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的產物，其含量高低是膜脂過氧化損傷程度的標志[8]，在整個試驗階段，MDA含量與H2O2含量表現出一致性。隨著處理時間的延長，對照的外植體內MDA不斷積累，而處理組的外植體內MDA含量一直維持在一個比較恒定的范圍內。這可能是由于在進行外植體的切割操作時，對外植體的細胞膜造成一定的傷害，導致對照組外植體內MDA含量的上升。而熱激處理后，可能由于“交叉適應”反應，細胞具有更強的適應機械損傷的能力，從而減輕了脅迫對外植體造成的傷害[9]。

經過熱激處理后，外植體的抗氧化酶活性有所提高，這些酶具有維護細胞膜穩定性的作用。SOD可以在短時間內清除氧自由基，CAT可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內的H2O2，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，進而減輕細胞膜損傷程度，減少酚氧化酶（PPO）與酚類底物氧化接觸的機會，最終有效抑制寶華甜柿葉片外植體酶促褐變的發生。

參考文獻：

[1] 羅正榮，蔡禮鴻，胡春根.柿屬植物種質資源及其利用現狀[J]. 華中農業大學學報，1996，15（4）：381-388.

[2] 李先明.寶華甜柿品種特性及栽培技術要點[J].西南園藝，2004，32（2）：68-70.

[3] 張妙霞，孔祥生，郭秀璞.柿樹組織培養防止外植體褐變的研究[J].河南農業大學學報，1999，33（1）：87-91.

[4] 王成韜.海南粗榧愈傷組織增殖及抗褐變研究[D].?？冢汉Ｄ洗髮W，2013.

[5] MARTIN-DIANA A B， RICO D， BARRY-RYAN C， et al. Effect of heat shock on browning-related enzymes in minimally processed iceberg lettuce and crude extracts[J]. Biosce Biotechnol Biochem，2005，69（9）：1677-1685.

[6] HEATH R L， PACKER L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts （I）： Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics， 1968， 125：189-198.

[7] YANG S H， WANG L J， LI S H，et al. The effects of UV-B radiation on photosynthesis in relation to photosystem Ⅱ photochemistry，thermal dissipation and antioxidant defenses in winter wheat （Triticum aestivum L.） seedlings at different growth temperatures[J]. Functional Plant Biology，2007，34： 907-917.

[8] 申 琳，生吉萍，羅云波.運輸中的機械損傷對貯藏初期蘋果活性氧代謝的影響[J].中國農業大學學報，1999，4（5）：107-110.

[9] BOWLER C，FLUHR R. The role of calcium and activated oxygens as signals for controlling cross-tolerance[J]. Trends in Plant Science， 2000，5：241-246.

1.2 測定方法

參照Heath等[6]的方法測定丙二醛（MDA）的含量，參照Yang等[7]的方法測定過氧化氫（H2O2）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性。

2 結果與分析

2.1 熱激處理對寶華甜柿外植體MDA含量的影響

從圖1可以看出，在培養的前6 d，處理組和對照MDA含量差異不明顯。從第6天開始，處理組的MDA 含量與對照有較大差異，其中第18天時二者差異最大，差異達到8.03 nmol/g，比對照低66.9%。MDA是膜脂過氧化產物之一，MDA含量越高，植株受到的傷害就越嚴重。熱激處理后MDA含量降低，表明在培養過程中，熱激處理保護了外植體細胞膜的完整性。

2.2 熱激處理對寶華甜柿外植體H2O2含量的影響

圖2顯示的是熱激處理后寶華甜柿外植體中H2O2含量的變化情況。從圖2中可以看出，處理組和對照H2O2含量的變化趨勢與MDA基本一致，也是在6 d時差距不明顯，6 d以后，對照H2O2含量明顯高于處理組。其中培養到第18天時，處理組的外植體中H2O2含量比對照組降低了30%。

2.3 熱激處理對寶華甜柿外植體SOD活性的影響

對比對照組與處理組寶華甜柿葉片外植體的SOD 活性變化趨勢，兩者均在第6天后開始有比較明顯的下降（圖3），從第12天以后維持在一個相對較低的水平。與對照相比，處理組的SOD活性在第6天高于對照，第12、18、24天分別比對照低50%、56.3%、50%。

2.4 熱激處理對寶華甜柿外植體CAT活性的影響

CAT能清除植株內產生的H2O2，從而使H2O2控制在較低水平。在整個檢測過程中，對照與熱激處理組的CAT活性變化趨勢基本一致，在第6～18天均有明顯增加，以后維持在一個穩定水平（圖4）。

2.5 相關分析

從表1可以看出，H2O2與MDA、SOD、CAT的相關系數分別為0.915 1、-0.909 6、0.976 8，與MDA和CAT呈正相關，而與SOD呈負相關性。

3 小結與討論

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的產物，其含量高低是膜脂過氧化損傷程度的標志[8]，在整個試驗階段，MDA含量與H2O2含量表現出一致性。隨著處理時間的延長，對照的外植體內MDA不斷積累，而處理組的外植體內MDA含量一直維持在一個比較恒定的范圍內。這可能是由于在進行外植體的切割操作時，對外植體的細胞膜造成一定的傷害，導致對照組外植體內MDA含量的上升。而熱激處理后，可能由于“交叉適應”反應，細胞具有更強的適應機械損傷的能力，從而減輕了脅迫對外植體造成的傷害[9]。

經過熱激處理后，外植體的抗氧化酶活性有所提高，這些酶具有維護細胞膜穩定性的作用。SOD可以在短時間內清除氧自由基，CAT可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內的H2O2，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，進而減輕細胞膜損傷程度，減少酚氧化酶（PPO）與酚類底物氧化接觸的機會，最終有效抑制寶華甜柿葉片外植體酶促褐變的發生。

參考文獻：

[1] 羅正榮，蔡禮鴻，胡春根.柿屬植物種質資源及其利用現狀[J]. 華中農業大學學報，1996，15（4）：381-388.

[2] 李先明.寶華甜柿品種特性及栽培技術要點[J].西南園藝，2004，32（2）：68-70.

[3] 張妙霞，孔祥生，郭秀璞.柿樹組織培養防止外植體褐變的研究[J].河南農業大學學報，1999，33（1）：87-91.

[4] 王成韜.海南粗榧愈傷組織增殖及抗褐變研究[D].海口：海南大學，2013.

[5] MARTIN-DIANA A B， RICO D， BARRY-RYAN C， et al. Effect of heat shock on browning-related enzymes in minimally processed iceberg lettuce and crude extracts[J]. Biosce Biotechnol Biochem，2005，69（9）：1677-1685.

[6] HEATH R L， PACKER L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts （I）： Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics， 1968， 125：189-198.

[7] YANG S H， WANG L J， LI S H，et al. The effects of UV-B radiation on photosynthesis in relation to photosystem Ⅱ photochemistry，thermal dissipation and antioxidant defenses in winter wheat （Triticum aestivum L.） seedlings at different growth temperatures[J]. Functional Plant Biology，2007，34： 907-917.

[8] 申 琳，生吉萍，羅云波.運輸中的機械損傷對貯藏初期蘋果活性氧代謝的影響[J].中國農業大學學報，1999，4（5）：107-110.

[9] BOWLER C，FLUHR R. The role of calcium and activated oxygens as signals for controlling cross-tolerance[J]. Trends in Plant Science， 2000，5：241-246.

1.2 測定方法

參照Heath等[6]的方法測定丙二醛（MDA）的含量，參照Yang等[7]的方法測定過氧化氫（H2O2）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性。

2 結果與分析

2.1 熱激處理對寶華甜柿外植體MDA含量的影響

從圖1可以看出，在培養的前6 d，處理組和對照MDA含量差異不明顯。從第6天開始，處理組的MDA 含量與對照有較大差異，其中第18天時二者差異最大，差異達到8.03 nmol/g，比對照低66.9%。MDA是膜脂過氧化產物之一，MDA含量越高，植株受到的傷害就越嚴重。熱激處理后MDA含量降低，表明在培養過程中，熱激處理保護了外植體細胞膜的完整性。

2.2 熱激處理對寶華甜柿外植體H2O2含量的影響

圖2顯示的是熱激處理后寶華甜柿外植體中H2O2含量的變化情況。從圖2中可以看出，處理組和對照H2O2含量的變化趨勢與MDA基本一致，也是在6 d時差距不明顯，6 d以后，對照H2O2含量明顯高于處理組。其中培養到第18天時，處理組的外植體中H2O2含量比對照組降低了30%。

2.3 熱激處理對寶華甜柿外植體SOD活性的影響

對比對照組與處理組寶華甜柿葉片外植體的SOD 活性變化趨勢，兩者均在第6天后開始有比較明顯的下降（圖3），從第12天以后維持在一個相對較低的水平。與對照相比，處理組的SOD活性在第6天高于對照，第12、18、24天分別比對照低50%、56.3%、50%。

2.4 熱激處理對寶華甜柿外植體CAT活性的影響

CAT能清除植株內產生的H2O2，從而使H2O2控制在較低水平。在整個檢測過程中，對照與熱激處理組的CAT活性變化趨勢基本一致，在第6～18天均有明顯增加，以后維持在一個穩定水平（圖4）。

2.5 相關分析

從表1可以看出，H2O2與MDA、SOD、CAT的相關系數分別為0.915 1、-0.909 6、0.976 8，與MDA和CAT呈正相關，而與SOD呈負相關性。

3 小結與討論

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的產物，其含量高低是膜脂過氧化損傷程度的標志[8]，在整個試驗階段，MDA含量與H2O2含量表現出一致性。隨著處理時間的延長，對照的外植體內MDA不斷積累，而處理組的外植體內MDA含量一直維持在一個比較恒定的范圍內。這可能是由于在進行外植體的切割操作時，對外植體的細胞膜造成一定的傷害，導致對照組外植體內MDA含量的上升。而熱激處理后，可能由于“交叉適應”反應，細胞具有更強的適應機械損傷的能力，從而減輕了脅迫對外植體造成的傷害[9]。

經過熱激處理后，外植體的抗氧化酶活性有所提高，這些酶具有維護細胞膜穩定性的作用。SOD可以在短時間內清除氧自由基，CAT可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內的H2O2，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，進而減輕細胞膜損傷程度，減少酚氧化酶（PPO）與酚類底物氧化接觸的機會，最終有效抑制寶華甜柿葉片外植體酶促褐變的發生。

參考文獻：

[1] 羅正榮，蔡禮鴻，胡春根.柿屬植物種質資源及其利用現狀[J]. 華中農業大學學報，1996，15（4）：381-388.

[2] 李先明.寶華甜柿品種特性及栽培技術要點[J].西南園藝，2004，32（2）：68-70.

[3] 張妙霞，孔祥生，郭秀璞.柿樹組織培養防止外植體褐變的研究[J].河南農業大學學報，1999，33（1）：87-91.

[4] 王成韜.海南粗榧愈傷組織增殖及抗褐變研究[D].海口：海南大學，2013.

[5] MARTIN-DIANA A B， RICO D， BARRY-RYAN C， et al. Effect of heat shock on browning-related enzymes in minimally processed iceberg lettuce and crude extracts[J]. Biosce Biotechnol Biochem，2005，69（9）：1677-1685.

[6] HEATH R L， PACKER L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts （I）： Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics， 1968， 125：189-198.

[7] YANG S H， WANG L J， LI S H，et al. The effects of UV-B radiation on photosynthesis in relation to photosystem Ⅱ photochemistry，thermal dissipation and antioxidant defenses in winter wheat （Triticum aestivum L.） seedlings at different growth temperatures[J]. Functional Plant Biology，2007，34： 907-917.

[8] 申 琳，生吉萍，羅云波.運輸中的機械損傷對貯藏初期蘋果活性氧代謝的影響[J].中國農業大學學報，1999，4（5）：107-110.

[9] BOWLER C，FLUHR R. The role of calcium and activated oxygens as signals for controlling cross-tolerance[J]. Trends in Plant Science， 2000，5：241-246.