南方紅豆杉紫杉醇產生菌的分離與鑒定

余響華+沈玉平+劉小文+張祖嬌

摘要：從南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei）根部樹皮內表皮中分離得到69株內生真菌，通過HPLC檢測發酵液中紫杉醇含量，共獲得7種紫杉醇產生菌，同時，通過形態學分析以及ITS序列分析確定分別屬于鏈格孢屬（Alternaria）、葡萄孢盤菌屬（Botryotinia sp.）、刺盤孢屬（Colletotrichum）、擬莖點霉屬（Phomopsis）和枝孢菌（Cladosporium），其中鏈格孢屬真菌紫杉醇產量最高，平均為271.54 μg/L，是目前見諸報道的產量最高的鏈格孢菌，亦是從紅豆杉根部樹皮中篩選出的紫杉醇產量較高的野生菌株之一。該菌株的發現為紫杉醇高產菌的選育提供了又一優良的種質資源。

關鍵詞：紫杉醇；南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei）；內生真菌；ITS序列；HPLC

中圖分類號：Q946.8；Q93-331 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）19-4552-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.011

Isolation and Identification of Endophytic Fungus Producing Paclitaxel

from Taxus chinensis var. mairei

YU Xiang-hua， SHEN Yu-ping， LIU Xiao-wen， ZHANG Zu-jiao

（Department of Life Science & Chemical Engineering， Hunan University of Science and Engineering ，Yongzhou 425100，Hunan， China）

Abstract： 69 strains of endophytes were isolated from root skin of Taxus chinensis var. mairei， which were belonged to 16 genera（groups） according to their morphological character. HPLC method was used to detect the concentration of paclitaxel in ferment. 7 strains were detected with the ability to synthesize paclitaxel. Combined with ITS sequence analysis， these 7 strains were identified as Alternaria、Botryotinia、Colletotrichum、Phomopsis and Cladosporium sp. The Alternaria sp. had the highest paclitaxel productivity， with the average up to 271.54 μg/L. It will provide another resource for selecting of high-yield strain of paclitaxel.

Key words： paclitaxel； Taxus chinensis var. mairei； endophytic fungi； ITS； HPLC

紫杉醇（Paclitaxel，商品名Taxol）是一種具有廣譜抗癌活性的三環二萜類化合物，1971年從太平洋短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）中分離獲得[1]，Schiff等[2]隨后證實紫杉醇具有獨特的抗癌機制。采用微生物發酵法，即從紅豆杉植物中尋找紫杉醇產生菌并加以菌種改良，結合微生物發酵技術以提高產量，是目前公認的環境友好、成本低廉的解決紫杉醇生產原料來源危機的好方法[3]。

自1993年Stierle等[4]從太平洋短葉紅豆杉樹皮中分離出可產紫杉醇內生真菌以來，國內外學者相繼開展了篩選產紫杉醇內生真菌的研究，到目前為止，人們已發現了20多個屬的內生真菌可以產生紫杉醇[5]，分離部位大部分取自樹干和樹枝。本研究從南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei）根部采集樹皮，從中分離篩選內生真菌，測定其產紫杉醇性能，以及通過形態特征和ITS序列分析對其進行了分類。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei）根部樹皮，來源于湖南省永州市陽明山國家森林公園內的野生紅豆杉，樣品采集后迅速裝入無菌塑料袋中，4 ℃保存。

1）培養基。固體培養基為PDA培養基，瓊脂 2.0%，滅菌后冷卻至40～50 ℃ 加入 25 mg/L鏈霉素，半固體培養基瓊脂濃度減半。液體種子培養基：PDA培養基不加瓊脂。發酵培養基（g/L）[6]：葡萄糖 1.0，果糖3.0，蔗糖6.0，醋酸鈉1.0，酵母粉0.5，MgSO4 0.36，KH2PO4 0.5，乙酸鈉2.0，ZnSO4 2.5×10-3，MnSO4 0.5×10-3，Cu（NO3）2 0.65，KCl 0.06，Ca（NO3）2 2×10-3， FeCl2 2×10-3，苯丙氨酸 5×10-3，苯甲酸鈉 0.5，KH2PO4 0.136。

2）試劑。紫杉醇標準品（純度>95%，Sigma）， HPLC 流動相甲醇為色譜純， 水為三蒸水，Ezup柱式真菌基因組抽提試劑盒（SK8259） ，PCR Buffer（10×），dNTP（10 mol/L），Taq酶（5U/μL），引物：ITS1和ITS4（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ 和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，由上海鉑尚生物合成）；其他試劑均為國產分析純。

3）儀器。日本島津LC-10ATvP高效液相色譜儀、旋轉蒸發儀、BIO-RAD PCR儀、恒溫搖床。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離與純化 將南方紅豆杉樹皮置于無菌條件下，剝除根部外皮，留取內皮和韌皮部，切割成邊長為0.5 cm×0.5 cm的正方形小塊，用75%的乙醇表面消毒2～3 min，無菌水漂洗2～3次；濾紙吸干水分，斜插入半固體培養基中，每皿6～8塊樹皮，共50皿。28 ℃培養3～7 d，挑取自真皮向培養基基質生長的菌絲體微絲于固體培養基中，純化2～3次，編號，保藏備用。

1.2.2 菌株的鑒定

1）形態學鑒定。將分離到的菌株于固體培養基，28℃恒溫培養，每隔12 h記錄菌落形態變化；顯微形態觀察采用插片法，40倍物鏡；綜合以上結果，依據菌落形態、菌絲體、孢子梗、營養細胞以及基質變化等特征，參考《真菌鑒定手冊》進行鑒定[7]。

2）分子生物學鑒定。按上海生工SK8259真菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株基因組DNA，以此為模板擴增ITS序列（擴增條件：預變性94 ℃、5.0 mim； 94 ℃、30 S，55 ℃、35 S， 72 ℃、1.0 min， 35個 循環；72 ℃延伸 8.0 min）

測序由上海鉑尚生物技術有限公司完成，所得序列經EMBL數據庫中的BLAST比對分析，并利用DNAMAN和MEGA軟件進行系統進化樹分析。

1.2.3 發酵培養 28 ℃接種待培養菌株至固體培養基，培養4～5 d，無菌生理鹽水洗下孢子，接種至20 mL裝液量的液體種子培養基中，3皿/瓶，28 ℃、220 r/min培養14～16 h后，將液體種子以8%的接種量接種至發酵培養基中，28 ℃、200 r/min搖床培養7 d。

1.2.4 紫杉醇的提取 發酵液4 800 r/min離心 20 min，收集上清液；所得菌體沉淀以 20 000 r/min 勻漿 15～20 min，使目標產物充分釋放，再離心；將兩次上清液合并，雙層濾紙過濾，濾液 50 ℃旋轉蒸發濃縮至原體積的 1/10，加入等體積氯仿充分振蕩進行萃取，共萃取兩次，合并有機相，無水Na2SO4 干燥，35 ℃旋轉蒸發至干，樣品加少量甲醇溶解，用0.45 μm微孔濾膜過濾， 定容至10 mL 備用。

1.2.5 樣品中紫杉醇含量的檢測

1）標準溶液配制。精確稱取紫杉醇標準品1.0 mg， 用10 mL甲醇溶解，配成100 mg/L母液備用。將母液稀釋成5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 mg/L系列濃度的標準溶液。

2）色譜條件。日本島津LC-10ATvP高效液相色譜儀，Kromstar C18 柱（250 mm×4.6 mm）；流動相， 甲醇∶水（V/V） =65∶35；流速1.0 mL/min， 檢測波長227 nm， 柱溫28 ℃， 進樣量10 μL。

2 結果與分析

2.1 內生真菌的分離及形態學鑒定

從南方紅豆杉樹皮中分離出69株內生真菌， 依據形態學鑒定，確定其分屬16屬。每個屬中挑選生長性狀優良的菌株，進行液體發酵培養，測定其發酵物的紫杉醇含量，相同種屬菌株取紫杉醇產量平均值，未檢出者則視為無效菌株，不在表內列出。共獲得7株產紫杉醇菌株，對應的鑒定結果及紫杉醇產量見表1。

2.2 紫杉醇含量的檢測

2.2.1 標準曲線的制作 取所配的紫杉醇標準品溶液，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作標準曲線，回歸方程為■=16 518x-9475.1，r2= 0.998 1。結果表明，回歸方程在0～40 mg/L范圍內線性關系良好（圖1）。

2.2.2 發酵液中紫杉醇的檢測 紫杉醇標準品和鏈格孢屬菌株（YEP751）發酵提取物的HPLC檢測結果見圖2和圖3。在相同色譜條件下，紫杉醇標準品的保留時間為23.574 min，菌株發酵濃縮液在此時間處有一明顯對應峰，即檢測到菌株代謝產物中含有紫杉醇。

2.3 紫杉醇產生菌的分子生物學鑒定

菌株YEP731、YEP822和YEP751 的ITS擴增序列分別為564、599、532 bp，該序列在EMBL數據庫中經BLAST比對，顯示與鏈格孢屬真菌（Alternaria sp.）有極高的同源性（99%），系統進化樹（圖4） 結果亦表明這3株菌株與鏈格孢屬真菌的親緣關系最近；菌株YEP821與葡萄孢盤菌屬真菌（Botryotinia sp.）的ITS序列有99%的一致性；菌株YEP742與葡萄刺盤孢屬真菌（Colletotrichum sp.）的ITS序列有99%的一致性；菌株YEP442與擬莖點霉屬（Phomopsis sp.）的ITS序列有99%的一致性；菌株YEP611與枝孢菌屬真菌（Cladosporium sp.）的ITS序列有99%的一致性。上述相關序列均在ENA（European Nucleotide Archive）完成注冊，相應EMBL登錄號為HG530662-HG530668。

3 討論

本試驗從南方紅豆杉的根部樹皮中分離得到69株內生真菌，形態學鑒定其分屬16屬， 通過HPLC法檢測發酵物中紫杉醇的含量， 發現有7株菌株能夠產生紫杉醇， 再經過ITS序列分析確定分別屬于鏈格孢屬（Alternaria）、葡萄孢盤菌屬（Botryotinia）、刺盤孢屬（Colletotrichum）、擬莖點霉屬（Phomopsis）和枝孢菌屬（Cladosporium）。 其中鏈格孢屬真菌（Alternaria）平均產量為271.54 μg/L（其中一株產量更是高達303.06 μg/L），是目前見諸報道的產量最高的鏈格孢菌[8-11]，亦是從紅豆杉根部樹皮中篩選出的紫杉醇產量較高的野生菌株之一[5]。隨著后續研究的跟進，其紫杉醇產量有望躍上一個新臺階。

參考文獻：

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