利用葉綠素熒光方法檢測東海浮游植物的營養鹽限制

沙相宇, 齊紅菊, 王昭玉, 譚麗菊, 王江濤

(中國海洋大學 化學化工學院, 山東 青島 266100)

東海是我國典型的陸架邊緣海, 受到氣候變化和人類活動的雙重影響, 長江口及東海海域海洋生態環境一直發生著變化。20世紀末以來, 隨著近海養殖業及沿岸工業的發展, 長江徑流和海上污染物的排放向東海海域輸入了大量有機態和無機態的營養物質, 導致東海海域營養鹽濃度升高, 形成了其特有的富營養環境[1-4]。豐富的營養鹽是微藻生長及赤潮暴發的物質基礎, 東海海域目前已經成為我國赤潮發生嚴重的區域。

營養鹽在時間和空間分布上是動態變化的, 而且浮游植物對氮、磷等營養元素的吸收、儲存能力以及利用細胞內的營養元素進行生存的潛力是不同的, 如徐寧等[5]發現裸甲藻雖然比柔弱海鏈藻和角毛藻對DIN、DIP的需求量較高, 低P的環境下一樣可以暴發甲藻的赤潮。因此, 通過傳統的、重復性的營養鹽測定來判斷一個海區的營養水平, 尤其是評估該海域浮游植物的光合作用等生理狀況已經不再是一個易行、有效的方法。本研究試圖通過葉綠素熒光變化來評估浮游植物的光合作用效率的高低,進而快速(24 h)、簡便的檢測海水中營養鹽對浮游植物生長的影響。

1 調查區域及站位分布

2011年6月10日- 6月27日利用“科學3號”科考船, 對長江口及東海陸架(120.8333°～126.0000°E,32.5000°～25.3450°N)海域進行了現場調查, 調查區域及站位如圖 1所示。大面站水樣由內附聚四氟乙烯涂層的采水器進行采集, 現場培養所用的海水為DH2-3站和 DH6-2站采集的表層海水, 分別為圖 1中上、下方框標出的站位。

圖1 長江口及東海陸架大面調查站位圖Fig.1 Sampling stations in the East China Sea

2 樣品分析

2.1 現場培養實驗

現場培養實驗所用的海水為 DH6-2、DH2-3站位采集的表層海水。培養所用容器為透明聚乙烯材料塑料桶, 培養容器的體積約為 5L。將上述培養容器置于兩側鑿有進出水孔的塑料箱中。為保持培養實驗的水溫與現場海水一致(現場水溫維持在 18℃左右), 實驗過程中用水泵將現場海水抽入塑料箱作為循環水, 并調整進出水口的大小使進出水的流量平衡。整套培養裝置固定于“科學3號”科考船后甲板。

實驗設計了8種不同的營養鹽添加方式, 分別為加N組; 加P組; 加Si組; 加N, P組; 加N , Si組; 加P , Si組; 加N , P , Si組和對照組, 實驗中添加的NO3-N、PO4-P、SiO3-Si營養鹽濃度如表1所示。

表1 現場培養實驗中添加的營養鹽濃度(μmol/L)Tab.1 The concentration of nutrient added in the microcosm experiment ((μmol/L))

實驗共設兩組, 每組8個培養桶。每個桶中加入過濾后混勻的4 L現場海水(200 μm篩絹過濾, 去除大體積的生物), 然后分別加入營養鹽, 使濃度和表1一致。營養鹽添加完畢后將培養桶放入塑料箱中進行水浴培養。實驗開始前取培養基, 測定水樣初始的Fv/Fm。同時取樣并固定, 帶回實驗室進行生物種類及生物量分析。培養24 h后測定各培養組的Fv/Fm,同時取樣進行營養鹽和生物量的分析。

2.2 分析方法

營養鹽水樣現場用 GF/F 玻璃纖維濾膜過濾后存于冰柜冷凍保存, 帶回實驗室用營養鹽自動分析儀(Bran+Luebbe, Germany)測定。活體熒光葉綠素和Fv/Fm在現場由 bbe藻類分析儀(bbe cuvette fluorometer, bbe Moldaenke, Germany)測定。該海域暗適應1 h基本上可以消除晝夜變化帶來的影響, 因此測定 Fv/Fm前都通過暗適應消除光對該方法的影響。浮游植物用魯戈試劑固定后在倒置顯微鏡下鑒定計數。水浴溫度由溫度計現場測定。

3 實驗結果及討論

3.1 調查海域葉綠素、Fv/Fm的平面分布

從葉綠素分布(圖2)可以看出, 0 m層葉綠素濃度范圍為0～22 μg/L; 10 m層葉綠素濃度范圍為0～10 μg/L,葉綠素高值區與 0 m層高值區分布一致, 但總體濃度略微偏低; 20 m層葉綠素濃度范圍為0～5 μg/L, 為三個調查層次葉綠素濃度最低的層。

Fv/Fm的平面分布與葉綠素的平面分布較為一致, 呈現出明顯的近岸高, 外海低的趨勢。

3.2 現場營養鹽加富培養實驗

本次現場培養所用海水為DH2-3站和DH6-2站采集的表層海水。

由圖 3可知, DH2-3站初始水樣中, 硅藻約占60%, 為優勢藻, 經過24 h培養后, 優勢種未發生明顯變化, 因此可以排除群落結構對方法造成的影響[6]。DH6-2站, 初始水樣中, 硅藻甲藻所占比例相似, 分別為35%、40%。經過24 h培養后, 比例未發生明顯變化。

DH2-3站和 DH6-2站營養鹽加富培養過程中,Chl和Fv/Fm的變化如圖4所示。

從圖4可以看出, DH2-3站水樣的Chl 初始濃度為4.00 μg/L, Fv/Fm初始值為0.40。與初始Chl濃度相比, 加N組; 加N、P組; 加N、Si組和加N、P、Si組24 h內葉綠素濃度增大; 而加P組、加Si組、加P、Si組和對照組24 h內濃度降低。與初始Fv/Fm相比, 加N組; 加N、P組和加N、P、Si組24 h內參數值增大; 而加P組、加Si組和對照組24 h內參數值降低; 加N、Si組和加P、Si組Fv/Fm24 h內沒有變化。

DH6-2站水樣的 Chl 初始濃度為 2.80 μg/L,Fv/Fm初始值為0.40。與初始Chl濃度相比, 加N組;加N、P組; 加N、Si組和加N、P、Si組24 h內濃度增大; 而加 P組; 加 Si組; 加 P、Si組和對照組24 h內濃度降低。與初始Fv/Fm相比, 加N組; 加N、P組; 加N、Si組和加N、P、Si組24 h內參數值增大; 而加P組、加Si組、加P、Si組和對照組24 h內參數值降低。

圖2 調查海域葉綠素及Fv/Fm的平面分布Fig.2 The horizontal distribution of Chl and Fv/Fm

分析數據可發現, 兩個站位普遍表現出培養基中N的添加使得Chl濃度和Fv/Fm數值增大, N的加富使得藻細胞的生長速度和細胞活性增強, 不同加N組的各參數增長幅度不一樣, 是因為水樣中藻類對不同營養鹽比例的反應不同所導致的。而無N添加的加P組和加Si組Chl濃度和Fv/Fm未見增大。另外, 未加N組的Chl濃度和Fv/Fm相比于對照組有所減小, 是因為加入的其他營養鹽導致N: P或者N: Si比例進一步減小, 加劇了藻細胞受到N限制的程度。從以上的數據分析都可以推出, 原始水樣中N含量不足, N的缺乏限制了藻細胞的生長和生理活性。

圖3 DH2-3和DH6-2站營養鹽加富培養24 h后優勢種所占比例的變化Fig.3 Changes in the composition of dominant species after 24 hs culture with enriched nutrients at DH2-3 and DH6-2 station

圖4 DH2-3和DH6-2站營養鹽加富培養24 h后Chl和Fv/Fm的變化Fig.4 Changes in Chl and Fv/Fm after 24hs culture with enriched nutrients at DH2-3 and DH6-2 station

4 討論

4.1 調查海域葉綠素、Fv/Fm

調查海域葉綠素的平面分布總體呈現近岸高,外海低的趨勢。葉綠素高值分布區主要有兩塊, 分別是長江口海域和浙江、福建沿岸海域。總體濃度0 m層＞10 m層＞20 m層。Fv/Fm的平面分布與葉綠素的平面分布較為一致。長江口及閩、浙近岸海域Fv/Fm數值在 0.5以上, 表明近岸海域浮游植物的生理活性較高, 光合作用較強。隨著離岸距離的增加,Fv/Fm數值明顯降低, 大小在 0.4以下, 代表此海域浮游植物生長受到了限制, 光合作用效率下降。營養鹽是微藻生長的物質基礎, 外海海域浮游植物Fv/Fm數值較低可能是由于較低的營養鹽濃度造成的, 而近岸海區微藻生長旺盛、Fv/Fm數值較高也是因為較高的營養鹽含量。與葉綠素所不同的是, Fv/Fm在0 m、10 m和20 m水層之間差別不明顯, 0～20 m內Fv/Fm在垂直分布上沒有明顯變化, 浮游植物光和效率在垂直方向上較為相似。

4.2 營養鹽加富現場培養實驗

目前關于我國東海海域的營養鹽限制情況有以下觀點: 胡明輝、沈志良等通過生物培養實驗和現場加富試驗指出長江口海區春夏季的浮游植物生長受P限制[7-8]; 趙衛紅等在長江口及鄰近海域的現場培養實驗表明, 離岸較遠的海域, N是潛在的限制因子,而在長江沖淡水影響海域, P為浮游植物生長的潛在限制因子, 兩者之間的海域是N、P的潛在限制過渡區[9-10]。DH2-3站位于趙衛紅等研究中的N、P潛在限制過渡區。2001年7月趙衛紅[11]在該海域進行了鹽度、透明度和營養鹽的調查, 并進行了浮游植物的營養鹽培養實驗, 根據實驗結果, 將該海域劃分為了近河口光限制海區、P潛在限制區、P潛在限制向N潛在限制過渡的海區、N潛在限制區, 并指出鹽度31分界線的兩側是浮游植物 N、P限制交替變化較活躍的海區。本次實驗的兩個站位都位于這一區域,其中DH2-3在P潛在限制向N潛在限制過渡的海區,DH6-2在 N潛在限制區, 因此可以推斷, 研究海域10年來營養鹽對浮游植物生長的限制情況沒有發生變化。營養鹽測定結果表明, DH2-3站表層海水的DIN 濃度為 5.60 μmol/L, DIP 濃度為 0.15 μmol/L, Si濃度為4.25 μmol/L。DIN/DIP為37。DH6-2站表層海水的DIN濃度為2.83 μmol/L, DIP濃度為0.13 μmol/L,Si濃度為5.32 μmol/L。DIN/DIP為22, 在Redfield 比附近。

浮游植物營養鹽限制的標準主要有以下幾種:Fisher等[12]認為 DIN=1 μmol/L、PO4-P=0.5 μmol/L、SiO3-Si=5 μmol/L為浮游植物生長的最低閾值。Justic等[13]根據以下的營養鹽濃度和比例來判斷限制因子:當 PO4-P<0.1 μmol/L、SiO3-Si/PO4-P>22 且 DIN/PO4-P>22, 則為 P 限制; 當 DIN<1 μmol/L、SiO3-Si/DIN>1且DIN/ PO4-P<10, 則為N限制; 當SiO3-Si<2 μmol/L、SiO3-Si/ PO4-P<10且 SiO3-Si/DIN<1, 則為 Si限制。另外, 如果用 AGP(藻類生長潛力)表示某一水體中浮游植物所能達到的最高生物量。如果缺少某一元素, AGP表示其限制作用的營養元素所能支持的生物量, 缺少某種營養元素的 AGP與全營養的AGP的比值小于50%的則認為該元素為限制元素,因此得到的是各種營養鹽對浮游植物生長的潛在限制強度, 潛在營養限制指數定義為: L(X)=0.5×AGP(All)/AGP(All-X), 如果 L(X)大于 1, 則元素 X 為限制因子,數值越大, 限制作用越強[14-17]。不同標準評價考察兩個站位所得的結果如表2。

表2 不同標準評價下DH2-3和DH6-2所受限制情況Tab.2 The restricted condition of DH2-3 and DH6-2 with different evaluation standards

由于浮游植物間吸收 DIN/DIP的差異性, 無法僅僅根據 DIN/DIP來斷定兩個站位的營養鹽限制情況。運用不同營養鹽限制評價標準得到的結果也不一樣。然而, 添加N后Chl濃度和Fv/Fm數值增大的實驗結果表明, N的加富會導致該海域浮游植物生物量的增大和細胞活性的上升, 因此, DH2-3站和DH6-2站浮游植物總體生長是受到潛在的N限制。可能是因為站位遠離長江口, 基本上不受長江的影響, 導致營養鹽濃度相對較低。同時由于臺灣暖流和黑潮北上, 攜帶了較豐富的P, 從而導致P的持續輸入, 最終導致該海區微藻受到潛在的N限制。

Moore 和 Almazán-Becerril等[18-19]發現, 在營養鹽較低的大洋海域, 加入營養鹽后Chl濃度升高, 而Fv/Fm卻沒有任何響應, 說明研究海域浮游植物的光合活性好、藻細胞的生理狀態良好, 因此Fv/Fm判斷的是藻類的生理是否受到限制、光合速率是否處于最大水平, 與生物量無關。將7種我國近海常見微藻在缺 N或 P的條件下培養數天, Fv/Fm均顯著下降;隨著限制性營養鹽的重新添加, 恢復過程中Fv/Fm在5～24 h顯著升高, 如果在5～24 h內藻類群落結構不發生顯著變化, 可運用該方法檢測營養鹽限制情況[6]。Sylvan等(2007)和 Hassler等(2011)在不同海域進行了營養鹽加富實驗, 24 h后測定Fv/Fm都得到了浮游植物對營養鹽的添加有響應的結果, 因此, Fv/Fm這一參數可以在24 h之內得到準確的實驗結果, 簡便、高效[20-21]。

5 結論

1) 調查海域葉綠素的平面分布總體呈現近岸高,外海低的趨勢。總體濃度0m層>10m層>20m層。Fv/Fm的平面分布與葉綠素的平面分布較為一致, 平面分布呈現出明顯的近岸高, 外海低的趨勢。

2) DH6-2站和DH2-3站營養鹽加富實驗結果表明, 培養基中N的添加使得Chl濃度和Fv/Fm數值增大, N的加富使得藻細胞的生長速度和細胞活性增強,而無N添加的實驗組Chl濃度和Fv/Fm未見增大。由此可以看出, 在調查時間, 原始水樣中 N的缺乏限制了藻細胞的生長和生理活性。實驗證明, 通過檢測不同的營養鹽添加前后 Fv/Fm的變化也可以說明該海域微藻生長受到了N限制, 方法快速(24 h)、簡便、快捷。

[1] 周名江, 朱明遠, 張經. 中國赤潮的發生趨勢和研究進展[J]. 生命科學, 2001, 13(2): 53-59.

[2] 周明江, 顏天, 鄒景忠. 長江口鄰近海域赤潮發生區基本特征初探[J]. 應用生態學報, 2003, 14(7):1031-1038.

[3] Anderson D M, Garrison D J. Ecology and oceanography of harmful algal Blooms [J]. Limnology and Oceanography, 1997, 42(5): 1009-1035.

[4] Hallegraeff G M. A review of harmful algal blooms and their apparent global increase [J]. Phycologia, 1993, 32:79-99.

[5] 徐寧, 陳菊芳, 王朝暉, 等. 廣東大亞灣藻類水華的動力學分析 Ⅱ.藻類水華與營養元素的關系研究[J].環境科學學報, 2001, 4: 400-404.

[6] 王昭玉, 王江濤. 7種海洋微藻葉綠素熒光對N、P限制的響應[J]. 海洋環境科學, 2013, 2: 165-170.

[7] 胡明輝, 楊逸萍, 徐春林, 等. 長江口浮游植物生長的磷酸鹽限制[J]. 海洋學報, 1989, 11(4): 339-443.

[8] 沈志良. 長江口海區理化環境對初級生產力的影響[J].海洋通報, 1993, 1: 47-51.

[9] 趙衛紅, 李金濤, 王江濤. 夏季長江口海域浮游植物營養限制的現場研究[J].海洋環境科學, 2001, 23(4): 1-5.[10] 周俊麗, 劉征濤, 孟偉, 等. 長江口營養鹽濃度變化及分布特征[J].環境科學研究, 2006, 19(6): 139-144.

[11] 趙衛紅, 王江濤, 李金濤, 等. 長江口及鄰近海域冬夏季浮游植物營養限制及其比較[J]. 海洋學報(中文版), 2006, 3: 119-126.

[12] Fisher E R, Peele J W, Ammerman L B, et al. Nutrient limitation of phytoplankton in Cheaspeake Delaware and Hudson estuaries[J]. Estuatine and coastal shelf science, 1988, 27: 61-93.

[13] Justic D, Rabalais N N, Turner R E, et al. Changes in nutrient structure of river-do minated coastal waters:stoichiometric nutrient balance and its consequences[J].Estuarine, Coastal and shelf Science, 1995, 40:339-356.

[14] Maestrini S Y, Breret M, Berland B R, et al, Nutrients limiting the algal growth potential(AGP) in the Po Riber Plume and an adjacent area, Northweat Adriatic Sea: Enrichment bioassays with the test algae Nitzschia closterium and Thalassiosira pseudonana[J]. Estuaries,1997, 20(2): 416-429.

[15] Louise Schlüter, The influence of nutrient addition on growth rates of phytoplankton groups, and microzooplankton grazing rates in a mesocosm experiment[J].Exp Mar Biol Ecol, 1998, 228: 53-71.

[16] 蒲新明, 吳玉霖, 張永山.長江口區浮游植物營養限制因子的研究(I.秋季的營養限制情況)[J].海洋學報,2000, 22(4): 60-66.

[17] 蒲新明, 吳玉霖, 張永山.長江口區浮游植物營養限制因子的研究(I.春季的營養限制情況)[J]. 海洋學報,2001, 23(3): 57-65.

[18] Almazán-Becerril A, García-Mendoza E. Maximum efficiency of charge separation of photosystem II of the phytoplankton community in the Eastern Tropical North Pacific off Mexico: A nutrient stress diagnostic tool? [J]. Ciencias Marinas, 2008, 34: 29-43.

[19] Moore C M, Mills M M, Langlois R, et al. Relative influence of nitrogen and phosphorus availability on phytoplankton physiology and productivity in the oligotrophic sub-tropical North Atlantic Ocean[J].Limnology and Oceanography, 2008, 53: 291-305.

[20] Hassler C S, Djajadikarta J R, Doblin M A, et al.Characterisation of water masses and phytoplankton nutrient limitation in the East Australian Current separation zone during spring 2008[J]. Deep-Sea Research Ⅱ, 2011, 58: 664-677.

[21] Sylvan J B, Quigg A, Tozzi S, et al. Eutrophicationinduced phosphorus limitation in the Mississippi River plume: Evidence from fast repetition rate fluorometry[J]. Limnology and Oceanography, 2007, 52: 2679-2685.