參附湯血中移行成分對阿霉素所致心肌細胞凋亡及自噬的影響＊

雷 雪，周俊佟，王雪梅，劉 佳，付殿彬，李麗靜

(長春中醫(yī)藥大學，長春 130117)

參附湯是療效確切的中醫(yī)名方，出自明代醫(yī)家薛己《正體類要》，為溫里劑中回陽救逆的代表方劑，由炮附子、人參組成，具有益氣回陽固脫功效，用于陽氣暴脫證、四肢厥逆、冷汗淋漓、呼吸微弱、脈微欲絕［2～4］等。阿霉素(adriamycin，Adr)屬于蒽醌類抗生素，具有抗瘤譜廣、作用強等特點，已在臨床上廣泛用于治療多種惡性腫瘤［1］，但其具有嚴重的心臟毒性作用。凋亡與自噬廣泛存在于正常細胞的生理過程中，如清除細胞廢物、結構重建、生長分化等，又是細胞對不良環(huán)境的一種防御機制，如對抗營養(yǎng)缺乏、電離輻射，同時還參與多種疾病的病理過程，無論是自噬過度還是自噬不足都可能導致疾病的發(fā)生。細胞在正常情況下很少會發(fā)生自噬，除非有誘發(fā)因素的存在。本實驗利用阿霉素所致乳鼠心肌細胞的凋亡及自噬模型，觀察參附湯對凋亡及自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

注射用鹽酸多柔比星(山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號02120603)、參附注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號110306，10 ml/支)、人參(吉林省宏檢大藥房)、附子(吉林省宏檢大藥房)。

1.2 動物

Wistar乳鼠SPF級(吉林大學動物中心提供，動物合格證SCXK(吉)-2011-0004)。

1.3 試劑

MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒(TaKaRa)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa)，SYBRPremix Ex Taq試劑盒 (TaKaRa)，DMEM(Hyclone)，胎牛血清(Hyclone)，谷氨酰胺(北京協(xié)和)，雙抗(Genview)，D-Hanks液(北京協(xié)和)，Ⅱ型膠原酶(Sigma)，胰蛋白酶(北京鼎國昌盛)，MTT(Sigma)，CCK-8試劑盒(碧云天)。

1.4 儀器

熒光倒置顯微鏡(奧林巴斯)、CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)、Bio Rad酶標儀(美國伯樂)、熒光定量pcr(美國Stratagene)。

1.5 方法

大鼠心肌細胞原代培養(yǎng):取48 h Wistar乳鼠，75%酒精消毒胸部皮膚，在胸骨左側約0.4 cm與3、4肋骨間交匯處開胸，擠壓使心臟跳出5～7］。剪掉心尖部分，放入盛有D-Hank’s液的培養(yǎng)皿中。將多余血液排出，剪掉多余組織在D-Hank’s液中沖洗3次。轉移至消化管中，使用眼科剪剪碎心臟組織約1 mm3。加入6～8 ml消化液(0.1%Ⅱ型膠原酶+0.25%胰蛋白酶)，使用吸管勻速吹打消化5 min，靜置30 s后棄上清［8］。繼續(xù)加入6 ml消化液，重復消化5次，取上清液轉移至離心管中，加等量的含10%胎牛血清培養(yǎng)液終止消化。1500 r/min，10 min離心，收集各個離心管中的沉淀加入等量的培養(yǎng)液再次離心，收集再次離心后的沉淀加入5 ml培養(yǎng)液吹打均勻，過200目篩網(wǎng)以除去未消化的組織塊，放入培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁1.5 h(37℃，5%CO2)。將差速貼壁后的細胞調(diào)整濃度為5×105分別接種于培養(yǎng)瓶、6孔板、24孔板、96孔板中［9］。將細胞放于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，12 h后伸出偽足，72 h后換液。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，心肌細胞伸出偽足且相互接觸連成片狀并可見搏動［10］。

含藥血清制備:以正常劑量的10倍量，取人參50 g、附子100 g加入10倍量蒸餾水煎煮3次，合并濾液濃縮至50 ml，4℃冰箱保存。使用前充分混勻并加熱至室溫。取10只Wistar大鼠(由吉林大學動物中心提供)按2 ml/100 g灌胃給藥，另取10只灌胃給予等量蒸餾水作為空白血清，連續(xù)給藥3d后腹主動脈取血，3000 r/min，10 min離心取上清，置于56℃恒溫水浴箱30 min進行滅活處理以消除補體活性后，過 0.22微孔濾膜，保存于 －20℃冰箱［11］。

1.5.1 分組及處理 將培養(yǎng)72 h后的心肌細胞去除原培養(yǎng)液更換無血清培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h后，按隨機數(shù)字表法分為空白組(10%空白血清DMEM)、陽性對照組(參附注射液 100 μL/ml)、模型組(阿霉素4 μmol)、參附湯組(10%參附湯血清DMEM)4組，先將空白組、陽性對照組、參附湯組給藥后培養(yǎng)12 h，模型組給予無血清培養(yǎng)液，全部棄去培養(yǎng)液，給予阿霉素(4 μmol)造模4 h，監(jiān)測各項指標［12］。

1.5.2 監(jiān)測指標 細胞活力檢測:1)MTT比色實驗法:將接種于96孔板的各組經(jīng)上述分組處理后，每孔加入MTT20 μ(5 g/l)與試驗孔平行設不加細胞只加相應量DMEM的空白對照孔，37℃繼續(xù)孵育4 h終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μLDMSO，震蕩10 min，使甲臜充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度值(A值)。存活率/%=(實驗組A值－空白對照A值)/(對照組A值－空白對照A值)×100%［13］。2)CCK-8試劑盒檢測細胞存活率:將接種于96孔板的各組經(jīng)上述分組處理后，與試驗孔平行設不加細胞只加相應量DMEM的空白對照孔，每孔加入10 μLCCK-8溶液，37℃繼續(xù)孵育4 h，選擇450 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度值(A值)。存活率/%=(實驗組A值－空白對照A值)/(對照組A－空白對照A值)×100%［14］。3)RNA的提取和Real Time PCR:①細胞總RNA的提取:按照TaKaRa公司MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒說明書操作，提取各組細胞總RNA。cDNA的合成:將抽提的總RNA為模板按照TaKaRa公司Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書合成 cDNA［15，16］;②引物設計:采用 primer 510軟件設計 Becline1引物序列:上游:5’GGCA GTGGCTCCT A TT-3’，下 游:5’-GGCGTGCT GTGCTCTGAAAA-3’;Atg5 引物序列:上游:5’-AGTGGAGGCAACAGAACC-3’，下游:5’-GACACG AA CTGGCAC ATT-3’;Caspase-3引物序列:上游:5-GCTGGACTGCGGTATTG AG-3’，下游:5＇-CCTG GAACATCGGATTTGATT-3’。同時 β-actin作為對照引物序列:上游:5’-CTG TAT GCC TCT GGT CGT AC-3’，下游:5’-TGA TGT CAC GCA TTT CC-3’［17］;③Real Time PCR:按照 TaKaRa 公司 SYBRR Premix Ex Taq試劑盒說明書配制PCR反應液20 μL，進行 Real TimePCR 反應，95℃ 熱啟動 5 min，95℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，40 個循環(huán)。分別擴增同一樣本的目的基因和對照基因，利用其Ct值進行相對定量。即用同組中每個樣本目的基因的Ct值減去對照基因的Ct值(ΔCt)，再用處理組的ΔCt減去對照組的 ΔCt(ΔΔCt)，代入公式 2－ΔΔCt計算，即得到處理組相對對照組PCR產(chǎn)物的濃度比值，以此來反映目的基因mRNA的表達量變化。我們所呈現(xiàn)的實驗結果是將β-act in作為內(nèi)參照進行的相對定量分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 MTT比色實驗法

與空白組比較，模型組細胞存活率明顯下降(P＜0.01)，參附湯組及陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與模型組比較，各組心肌細胞存活率均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或 P＜0.01)。

2.2 CCK-8試劑盒檢測細胞存活率

與空白組比較，模型組細胞存活率明顯下降(P＜0.01)，參附湯組及陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與模型組比較，各組心肌細胞存活率均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或 P＜0.01)。

表1 4 組細胞存活率比較(±s，%)

表1 4 組細胞存活率比較(±s，%)

注:與空白組比較:*P＜0.05，＊＊ P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.05，▲▲P ＜0.01

組別 例數(shù)MTT CCK-8空 白 組5 100±2.459 100±1.744模 型 組 5 65.36±1.705＊＊ 65.44±1.122＊＊陽性對照組 5 88.08±1.098▲▲ 89.98±1.560▲▲參 附 湯 組 5 85.52±1.79▲▲ 87.52±2.070▲▲

2.3 凋亡及自噬相關基因mRNA的表達

與模型組比較，參附湯組與陽性對照組Caspase mRNA的表達量均明顯下降，參附湯組與陽性對照Beclin1、Atg5 mRNA的表達量均明顯下降。

表2 4組凋亡及自噬相關基因mRNA的表達

圖1 凋亡及自噬相關基因mRNA的表達

3 討論

從細胞水平進行心肌保護研究已成為近年來的熱點，其最大優(yōu)點在于排除在體心臟模型中全身性神經(jīng)因素和體液因素的影響，以及離體心臟不同類型細胞間的相互作用，因此本實驗采用培養(yǎng)乳鼠心肌細胞作為觀察對象。本實驗利用阿霉素具有的心臟毒性致使心肌細胞發(fā)生凋亡及自噬，分別采用MTT比色法和CCK-8試劑盒檢測心肌細胞存活率。與MTT比較，CCK-8具有檢測快速、靈敏度高、重復性好、使用方便等優(yōu)點。本實驗采用2種方法檢測得到的結果更為準確，其檢測結果可以看出，參附湯組細胞存活率較高，說明參附湯對阿霉素所致的襲擊細胞損傷有一定的抑制作用。采用Real Time PCR檢測凋亡相關基因caspase和自噬相關基因Beclin1、Atg5的表達水平，從實驗結果中可以看出參附湯對凋亡和自噬有抑制作用。課題組研究表明，參附湯血中移行成分可保護缺氧復氧的心肌細胞，具有抑制細胞凋亡和自噬作用;參附湯及其血中移行成分對大鼠急性心衰具有一定的治療作用，并能調(diào)整心臟的能量代謝［18，19］。

［1］潘躍銀，徐淑萍，魏偉.尼美舒利與阿霉素聯(lián)合應用對肝癌HepG2細胞增殖及凋亡的影響［J］.中國藥理學通報，2006，22(7):884-7.

［2］戴世學，劉強，鄭學寶.參附湯治療心衰的藥理機制及臨床應用［J］.陜西中醫(yī)學院學報，2006，29(5):56-57.

［3］孫亞武，陸曙.參附湯在急性心肌梗死合并心原性休克中的治療作用［J］.中國醫(yī)藥導報，2006，5(34):66-67.

［4］沈燕，吳立軍，王本祥.參附湯體內(nèi)代謝化學成分的初步研究［J］.沈陽藥科大學學報，2001，18(1):23-26.

［5］黃勤歡，黃瑾.人外周血T淋巴細胞自噬現(xiàn)象的觀察［J］.中國免疫學雜志，2007，23(6):500-503.

［6］何偉，張明雪，閆麗娟.乳鼠原代心肌細胞培養(yǎng)概要［J］.實用心腦肺血管病雜志，2009，17:339-40.

［7］楊瑞豐，潘偉.心肌細胞培養(yǎng)進展［J］.中國心血管病研究雜志，2005，3:634-636.

［8］王瑞華，蘭曉莉，曹國祥，等.新生sd大鼠心肌細胞培養(yǎng)方法的簡化及改良［J］.心臟雜志，2008，20:154-7.

［9］Kalyanaraman B，Joseph J，Kalivendi S，et a.l Doxorubicin-Induced apotosis: implications in cardiotoxicity［J］.Mol CellBiochem，2002，234-235(122):119-124.

［10］Cohn GM.Caspase:the executioners of apoptosis［J］.Biochem J，1997，326(Pt1):1-16.

［11］WangL，MaW，Markovich R，et a.l Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I［J］.Circ Res，1998，83(5):516-522.

［12］文柳靜.多柔比星心臟毒性的研究［J］.中國藥師，2006，9(10):956-958.

［13］王贊宏.自噬與腫瘤［J］.國外醫(yī)學·婦產(chǎn)科學分冊，2007，34(6):401-404.

［14］葉青.自噬的分子機制與病理生理意［J］.國際病理科學與臨床雜志，2007，27(8):358 －362.

［15］Shin IW，Jang IS，Lee SH，Baik JS，Park KE，Sohn JT，et al.Propofol has delayed myocardial protective effects after a regional ischemia/reperfusion injury in an in vivo rat heart model［J］.Korean JAnesthesiol，2010，58:378-382.

［16］Mizushima N.Methods for monitoring autophagy［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36(12):2491-2502.

［17］Seglen PO，Gordon PB.3-Methyladenine:specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1982，79(6):1889-1892.

［18］李麗靜，劉佳，李玉梅，等.參附湯血中移行成分對缺氧復氧心肌細胞凋亡和自噬的影響［J］.中醫(yī)藥臨床，2012，56(4):773-775.

［19］李麗靜，李秋明，王晶華，等.參附湯血中移行成分對心源性休克大鼠血流動力學及能量代謝的影響［J］.中藥藥理與臨床，2010，28(3):19-21.