行輔助生殖技術患者流產胎兒人白細胞抗原－G基因14bp插入／缺失多態性分析

李觀貴，吳彤華，朱元昌，尹彪，宋成，陳曉燕，曾勇，林奇

（廣東深圳中山泌尿外科醫院生殖醫學中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045）

約有10%～15%的人妊娠后流產，其中大部分的流產是由胎兒的遺傳學異常，如染色體非整倍體、基因突變或多態性等引起。流產越早發生，胎兒的遺傳學異常機率也越高［1］。研究表明，50%～80%的流產胎兒染色體為非整倍體，是引起流產的最主要原因［1］。然而，對于染色體數目正常的流產胎兒，其流產原因往往難以確定。

人類白細胞抗原G（HLA－G）屬于I類非經典主要組織相容性復合物，限制性表達于母胎界面的外滋養層細胞。其可抵制自然殺傷細胞（NK細胞）、T淋巴細胞及樹突狀細胞等免疫細胞的功能，在胚胎種植及妊娠維持中發揮重要作用［2，3］。與其他HLA基因的高多態性不同，HLA－G的基因的多態性非常低，訖今僅發現23種等位基因。其中，HLA－G基因3’端非翻譯區（3’－untranslated region，3’－UTR）的14bp插入／缺失多態性與 HLA－G的表達及功能密切相關［4，5］。

HLA－G基因14bp插入可導致其轉錄產生的mRNA在3’－UTR區缺失92bp長度的片段，影響mRNA的穩定性及翻譯，從而使HLA－G的合成及濃度降低［5］。此外，行輔助生殖技術患者胚胎體外培養的培養液中可溶性HLA－G分子（由胚胎分泌）的濃度與胚胎著床成功與否呈正相關，表明胚胎分泌足夠濃度的可溶性HLA－G分子對胚胎種植及妊娠維持至關重要［6，7］。因此，胚胎 HLA－G基因14bp多態性可能影響胚胎HLA－G的合成，進而導致胎兒流產。

有學者研究表明，母方的 HLA－G基因14bp插入／缺失多態性與復發性流產呈相關性，提示其在流產中發揮重要作用，然而這些研究未能排除胎兒的非整倍體情況［5，8］。胚胎滋養層細胞是表達HLA－G的主要來源，流產后的胎兒在排除染色體非整倍體后，其HLA－G基因14bp插入／缺失多態性情況與流產的相關性可能更為重要。

材料與方法

一、研究對象

2011年3月至2012年12月，于我院生殖中心行體外受精（IVF）或卵胞漿內單精子注射（ICSI）技術治療的患者，符合以下條件者入選：生殖系統無器質性病變；性激素正常；無已知的免疫性疾病；妊娠后12周內流產；流產物經多重連接依賴式探針擴增技術（MLPA，檢測相關結果另文發表）檢測23對染色體數目均正常［9］。共82例流產胎（IVF＋ICSI流產組）符合條件入選，其中通過IVF方式妊娠的流產胎47例（IVF流產組），通過ICSI方式妊娠的單胎胎兒35例（ICSI流產組）。同時，自然單胎妊娠且孕周≤12的患者于我院婦科行選擇性人工流產，經MLPA技術檢測23對染色體正常的胎兒共49例作為對照組。

二、樣本收集

刮宮產物于生理鹽水中清洗數遍，在體視鏡下用剪刀分離絨毛或胎兒組織，并于生理鹽水中沖洗3遍，以去除血塊等母體成份的污染。胎兒組織用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，德國）提取 DNA，按說明書操作。DNA保存于－80℃備用。

三、HLA－G基因14bp多態性分析

根據GenBank公布的人類HLA－G基因序列設計引物，正向引物序列：5’－GTG ATG GGC TGT TTA AAG TGT CAC C－3’（5’末端用熒光素標記），反向引物序列：5’－GGA AGG AAT GCA GTT CAG CAT GA－3’。應用上述引物使用 PCR 方法擴增 HLA－G基因3’－UTR區，PCR擴增條件為：95℃預變性5min；然后95℃變性30s，68℃復性30s，72℃延伸1min，共35個循環；最后72℃再延伸5min。聚合酶鏈反應（PCR）產物用 Hidi－formamide（Applied Biosystems，美國）變性，以 LIZ－500（Applied Biosystems，美國）為標準品，于 AB 3500遺傳分析儀（Applied Biosystems，美國）進行片段分析。PCR產物有224bp和210bp兩種片段，其中224bp長度的序列代表14bp插入（＋14bp），而210bp長度片段代表14bp缺失（－14bp）。

四、統計學分析

用SPSS 16.0軟件行t檢驗及卡方檢驗分析數據。如P＜0.05則認為有統計學差異。

結 果

一、PCR擴增與產物分析

通過PCR技術成功擴增到 HLA－G基因3’－UTR特異性片段，其中＋14bp片段長度位于224bp位置附近，－14bp片段長度位于210bp位置附近，與預期大小相符（圖1）。兩種片段產物經回收純化后測序鑒定，確認與目標序列相符（圖2）。

圖1 HLA－G基因14bp多態性片段分析

圖2 HLA－G基因14bp多態性測序結果

二、等位基因頻率分析

IVF流產組HLA－G基因14bp插入的頻率為35.11%，14bp缺失的頻率為64.89%；ICSI流產組HLA－G基因14bp插入的頻率為31.43%，14bp缺失的頻率為68.57%；IVF＋ICSI流產組 HLA－G基因14bp插入的頻率為33.54%，14bp缺失的頻率為66.46%；對照組HLA－G基因14bp插入的頻率為41.84%，14bp缺失的頻率為58.16%。各組間等位基因多態性頻率均無統計學差異（P＞0.05）（表1）。

表1 流產組及對照組HLA－G基因14bp等位基因型頻率分布比較

三、基因型頻率分析

IVF流產組 HLA－G 基因＋14／＋14、＋14／－14和－14／－14的基因型頻率分別為10.64%、48.94% 和 40.43%；ICSI 流 產 組 HLA－G 基 因＋14／＋14、＋14／－14和－14／－14的基因型頻率分別為5.71%、51.43%和42.86%；IVF＋ICSI流產組 HLA－G基因＋14／＋14、＋14／－14和－14／－14 的 基 因 型 頻 率 分 別 為 8.54%、50.00% 和41.46%；對照組 HLA－G 基因＋14／＋14、＋14／－14和－14／－14的基因型頻率分別為18.37%、46.94%和34.69%。各組間基因型頻率均無統計學差異（P＞0.05）（表2）。

表2 流產組及對照組HLA－G基因型頻率分布比較

討 論

輔助生殖技術已成為治療不孕不育最有效的方法之一，然而治療妊娠后的患者約有10%～15%會發生早期流產，是當前輔助生殖技術面臨的主要問題之一。流產原因眾多，其中染色體非常倍體最為常見，是引起流產的最主要原因［1］，但其他流產病因至今大部分仍不明確。HLA－G作為影響胚胎著床及妊娠維持的重要因子，其表達或功能異常可能是導致流產的原因之一。

在妊娠期間，胎兒能在母體宮腔內順利發育而不被排斥，其主要原因是滋養細胞不表達經典的主要組織相容性復合體（MHC）I、II和III類分子，只表達非經典的MHC I類分子如HLA－G等。HLAG維持妊娠的機理包括：（1）直接或間接抑制NK細胞；（2）與蛻膜組織中的T細胞結合，抑制T細胞殺傷；（3）調節T輔助性細胞因子分泌，促使Th2偏移；（4）可溶性 HLA－G分子通過激活Fas／FasL旁路，引起活化母體CD8＋T細胞的凋亡［10］。1993年由Harrison等［11］首次報道了 HLA－G第8外顯子（14－bp／14＋bp）多態性，在對靈長類動物的MHC－G進化過程研究中發現，這種14bp多態性屬于缺失性多態，而非插入性多態。

早期研究主要關注母方或父母雙方的HLA－G基因3’－UTR中14bp插入／缺失多態性與復發性流產的相關性，多數研究認為其與復發性流產的發生相關［5，8］，但也有文獻報道兩者無相關性［12］。 本文則對行輔助生殖技術后流產，經MLPA方法檢測染色體數目正常的胎兒 HLA－G基因3’－UTR中14bp插入／缺失多態性進行分析，以期揭示其與流產發生的相關性。結果顯示，HLA－G的等位基因頻率及基因型頻率在流產組及對照組中相當，無統計學差異，提示其可能不是導致流產發生的原因。Moreau等［13］研究發現，流產胎盤的 HLA－G基因14bp多態性與對照組相似，我們的研究結果與其一致。但是，本文僅對基因多態性進行檢測，未對其表達產物進行定量分析。后期研究可進一步研究流產胎兒的不同14bp基因型的HLA－G的蛋白表達情況及其與流產的關系。

本研究觀察到的一個現象：在對照組中HLAG基因＋14／＋14純合基因型的頻率較IVF組或ICSI組均高，這與我們的預期結果相反。Sipak－Szmigiel等［12］對波蘭復發性流產患者進行研究時同樣發現，對照組的＋14／＋14純合基因型頻率較復發性流產患者高，我們的結果與其類似。出現這種情況的原因目前仍不明確，可能與研究的樣本數較少或人種有關。

［1］Simpson JL.Causes of fetal wastage［J］.Clin Obstet Gynecol，2007，50：10－30.

［2］Le Gal FA，Riteau B，Sedlik C，et al.HLA－G－mediated inhibition of antigen－specific cytotoxic T lymphocytes［J］.Int Immunol，1999，11：1351－1356.

［3］Contini P，Ghio M，Poggi A，et al.Soluble HLA－A，－B，－C and－G molecules induce apoptosis in T and NK CD8＋cells and inhibit cytotoxic T cell activity through CD8ligation［J］.Eur J Immunol，2003，33：125－134.

［4］Hviid TV，Hylenius S，Rorbye C，et al.HLA－G allelic variants are associated with differences in the HLA－G mRNA isoform profile and HLA－G mRNA levels［J］.Immunogenetics，2003，55：63－79.

［5］Tripathi P，Abbas A，Naik S，et al.Role of 14－bp deletion in the HLA－G gene in the maintenance of pregnancy［J］.Tissue Antigens，2004，64：706－710.

［6］Rebmann V，Switala M，Eue I，et al.Soluble HLA－G is an independent factor for the prediction of pregnancy outcome after ART：a German multi－centre study［J］.Hum Reprod，2010，25：1691－1698.

［7］Desai N，Filipovits J，Goldfarb J.Secretion of soluble HLA－G by day 3human embryos associated with higher pregnancy and implantation rates：assay of culture media using a new ELISA kit［J］.Reprod Biomed Online，2006，13：272－277.

［8］Wang X，Jiang W，Zhang D.Association of 14－bp insertion／deletion polymorphism of HLA－G gene with unexplained recurrent spontaneous abortion：a meta－analysis［J］.Tissue Antigens，2013，81：108－115.

［9］吳彤華，尹彪，朱元昌，等 .輔助生殖和自然妊娠中早期自然流產胚胎染色體數目異常的研究［J］.生殖與避孕，2013，33：16－23.

［10］Hunt JS，Petroff MG，McIntire RH，et al.HLA－G and immune tolerance in pregnancy［J］.FASEB J，2005，19：681－693.

［11］Harrison GA，Humphrey KE，Jakobsen IB，et al.A 14bp deletion polymorphism in the HLA－G gene［J］.Hum Mol Genet，1993，2：2200.

［12］Sipak－Szmigiel O，Cybulski C，Lubiński J，et al.HLA－G polymorphism in a Polish population and reproductive［J］.Tissue Antigens，2008，71：67－71.

［13］Moreau P，Contu L， Alba F，et al.HLA－G Gene Polymorphism in Human Placentas：Possible Association of G＊0106Allele with Preeclampsia and Miscarriage［J］.Biol Reprod，2008，79：459－467.