11β－羥化酶缺陷癥遺傳學研究現狀

王曉晶，聶敏，孫梅勵

（中國醫學科學院，北京協和醫學院，北京協和醫院內分泌科；衛生部內分泌重點實驗室，北京 100730）

先天性腎上腺皮質增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是一組由皮質醇生物合成過程中某一種酶缺陷引起的常染色體隱性遺傳病。11β－羥化酶缺陷癥（11β－Hydroxylase deficiency，11β－OHD）是僅次于21－羥化酶缺陷癥（21α－OHD）引起CAH的第二大病因，約占CAH的5%～8%。其在普通人群中的發病率為1／100，000～1／200，000活產兒，而在近親結婚較普遍的從摩洛哥移民到以色列的猶太人群中，發病率高達1／7，000～1／5，000活產兒［1］。

11β－OHD 是由 CYP11B1基因突變所致，CYP11B1基因突變使P450c11B1的11β－羥化酶活性受損，11－去氧皮質醇轉化為皮質醇受阻，合成皮質醇的前體物質：11－去氧皮質酮（DOC）、17－羥孕酮等大量堆積，同時轉而合成過多的雄激素。血清高水平的DOC由于其具有弱鹽皮質激素的作用，導致水鈉潴留，血容量增加，抑制腎素的合成，造成約2／3的經典型11β－OHD患者有低腎素性高血壓［2］；而過多的雄激素引起男性患兒性早熟以及女性外生殖器男性化。然而，非經典型11β－OHD患者，血壓一般正?；騼H有輕度升高，女性患者出生時外生殖器正常，青春期前后可出現陰蒂肥大等雄激素過多癥狀，成年婦女可有多毛、月經稀發等表現。

近年來，隨著分子生物學技術的發展以及對新生兒優生優育的重視，目前有關CYP11B1基因新突變位點的報道增多并隨之對其功能的研究亦逐漸增加。本文將綜述11β－羥化酶缺陷癥分子遺傳學的研究現狀。

一、11β－OHD分子遺傳基礎

11β－OHD為常染色體隱性遺傳病，其致病基因為CYP11B1。CYP11B1定位于8號染色體長臂2區1帶（8q12），總長度為6.03kb，共含有9個外顯子，編碼由503個氨基酸組成的P450c11B1蛋白；CYP11B2編碼醛固酮合成酶，位于CYP11B1上游約45kb處，與CYP11B1具有高度同源性，二者的外顯子和內含子的相似度分別高達95%和90%，兩者的主要區別在于CYP11B2基因第5內含子多插入442個堿基對［3］。CYP11B1基因突變，使11β－羥化酶活性減弱或喪失，導致11β－羥化酶缺陷癥。White等［4］于1991年首次報道了CYP11B1基因突變（R448H）引起11β－OHD。到目前為止，文獻報道的CYP11B1基因突變已達70余種，包括錯義突變、無義突變、插入、缺失以及剪切位點的突變等，這些突變位點在所有外顯子區均有分布，但主要集中在第2、3、6、7、8外顯子區［3］（圖1），推測與這些外顯子區富含GpC位點以及其所對應的氨基酸相對保守有關。我室對12例就診于北京協和醫院，初步診斷為11β羥化酶缺陷癥的患者行CYP11B1基因突變檢測，發現了9種CYP11B1基因新突變，包括4種錯義突變，2種無義突變以及剪切位點突變，純合插入突變和缺失突變各一種，且主要集中在第3和第8外顯子區（文章待發表），與已報道的研究［3］結果一致。

圖1 已知CYP11B1基因突變類型簡圖

二、CYP11B1基因突變對P450c11B1酶活性的影響

1.CYP11B1基因錯義突變與酶活性：錯義突變是CYP11B1基因突變最常見的類型，目前已報道50余種，主要通過蛋白三維結構模擬和體外蛋白表達實驗研究其對酶活性的影響。P450c11B1酶作為P450c11的一種，以血紅素為輔基催化氧化還原反應，其三維結構模擬圖（圖2）顯示I～L螺旋（helix）屬于高度保守的血紅素結合區，其中第450位的半胱氨酸（C450）巰基與血紅素鐵原子相結合，形成酶活性位點之一［3，5］，因此，C450鄰近的氨基酸改變，均會影響血紅素與酶的結合，使酶活性喪失。體外研究也證實，R427H、V441G、G444D、G446V、R448H、R453Q、R454C突變均使酶活性喪失［6－9］，其中R454C突變僅在中國人群中發現。此外，I螺旋是底物“結合袋”的一部分，含有許多疏水性氨基酸以及潛在的酶活性位點，參與底物的識別與結合，研究顯示I螺旋構像輕微的改變，即可導致P450c11B1酶活性嚴重受損［10］。脯氨酸取代亮氨酸（L299P）改變了I螺旋的空間位置，血紅素極性與非極性部分的空間位置也發生重排，使酶活性降至（1.6±0.8）%［11］。368位的丙氨酸（A368）與V336、L340相互作用維持其周圍的疏水環境，酸性天冬氨酸取代中性丙氨酸（A368D）同樣會改變I螺旋的構像，使酶活性降至（1.17±1.9）%［10］。同理，P94L改變K－L環的方向［10］；位于K螺旋、I螺旋的A331V、E371G突變改變了酶的3級結構［12］，均使酶活性喪失。

F和G螺旋以及G螺旋和I螺旋間的B－C環是底物進入酶活性中心與其結合的潛在通道，尤其G螺旋是底物初始識別所必需的。A259位于G螺旋，A259D突變打破了丙氨酸周圍的疏水環境，使酶與底物的結合障礙，酶活性受損［6］。W116位于B－C環，116位色氨酸被取代，同樣使酶與底物結合受阻，酶活性喪失，目前發現該位點有 W116X、W116G、W116C三種突變［13］，高度保守的 T318同樣已發現 T318R、T318M、T318P三種突變［12］，表明W116和T318位點可能不穩定，易于發生突變。此外，V129M、V148G、R384Q、R384G等突變均因影響了酶與底物的結合，使酶活性下降。

總之，CYP11B1基因錯義突變均不同程度的影響了P450c11B1酶的空間構象，尤其是維持酶活性關鍵區的構象，從而影響了酶活性。對發現的突變位點進行蛋白三維結構的模擬將有助于合理解釋和進一步證實體外蛋白表達實驗的研究結果。

2.CYP11B1基因無義突變和框移突變與酶活性：目前已報道10余種CYP11B1基因無義突變。無義突變使終止密碼子提前出現，蛋白質翻譯提前終止，導致截短蛋白產生，若維持酶活性的重要氨基酸（如血紅素結合區的第443位至463位之間氨基酸）缺失，將使酶活性喪失。已發現的CYP11B1基因無義突變均使血紅素結合區的氨基酸缺失。

圖2 P450c晶體結構［5］

插入或缺失突變使閱讀框架移動，相應的氨基酸序列改變，翻譯出錯誤蛋白，同時提前出現終止密碼子，蛋白表達提前終止，使酶蛋白的相應功能結構域發生改變或缺失，酶活性喪失。如最新報道的框移突變g.2697del449、c.652－653insT、g.4671－4672insG、c.1359－1360insG分別使第165位的丙氨酸、218位的絲氨酸、404位精氨酸和第454位精氨酸分別轉變為丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和丙氨酸，并且蛋白表達分別于第217、258、421和468位提前終止［1，14－16］，高度保守的血紅素結合區氨基酸缺失或改變，酶活性喪失。

3.CYP11B1基因剪切位點突變與酶活性：關于CYP11B1基因剪切位點突變的報道較少。剪切位點突變會導致mRNA成熟前的錯誤剪切，可以表現為原有的剪切信號（5’GT－AG3’）隱藏、潛在的剪切位點激活形成新的剪切位點或直接跳過整個外顯子在下一個外顯子剪切信號處剪切等，從而形成錯誤的轉錄本，表達出錯誤蛋白，使酶活性喪失。如IVS8＋4A＞G突變，剪切時跳過第8外顯子，使成熟的mRNA缺乏第8外顯子，酶活性喪失。同理，IVS7＋4A＞G、IVS7－9C＞A、IVS5＋2T＞G等剪切位點的突變［5，15，17］，均因錯誤剪切而使酶活性喪失。

4.CYP11B1基因嵌合突變與酶活性：由于CYP11B1與CYP11B2基因高度同源，減數分裂時，兩者可發生不平等等位基因交換，產生CYP11B2－CYP11B1嵌合基因，其啟動子區由CYP11B2提供，受血管緊張素II（AngⅡ）和K＋的調節，盡管體外研究顯示，該嵌合基因編碼的蛋白質具有11β－羥化酶的活性，但由于CYP11B2只在腎上腺球狀帶表達，因此，不能催化束狀帶11－去氧皮質醇轉化為皮質醇。若患者為CYP11B2－CYP11B1嵌合基因純合子或為含有CYP11B2－CYP11B1嵌合基因的復合雜合子，則表現為11β－羥化酶缺陷癥。目前，共報道了3例由CYP11B2－CYP11B1嵌合基因引起的11β－OHD。Hampf 等［18］首次報道了一例攜帶CYP11B2－CYP11B1嵌合基因的復合雜合子患者，CYP11B2－CYP11B1嵌合基因由CYP11B2的1～4外顯子和CYP11B1的5～9外顯子組成，該患者另一條等位基因攜帶IVS3＋16G＞T剪切位點突變；Kuribayashi 等［19］報道一例高加索患者為CYP11B2－CYP11B1／G314R復合雜合子，嵌合基因由CYP11B2的1～3外顯子和CYP11B1的4～9外顯子組成；另一例為CYP11B2－CYP11B1純合突變患者，該嵌合基因由CYP11B2的1～6外顯子和CYP11B1的7～9外顯子組成［20］。對臨床表現符合11β－羥化酶缺陷癥的患者，如果用正常引物無法擴增出CYP11B1基因，應想到CYP11B2－CYP11B1純合突變的可能性。

5.基因型與表型關系：非經典型11β－OHD患者可無或有輕度高血壓，或有輕度的雄激素過多的表現，研究發現這些患者不典型的臨床表現與其CYP11B1基因突變對酶活性的影響相對較小有關。Joehrer等［21］首次對兩例非經典型11β－OHD 患者進行了分子遺傳學研究，該兩例患者分別為N133H／T319M和P42S／Y423X復合雜合子，體外實驗發現P42S、N133H、T319M突變使酶活性保留15%～40%。此后，Peters等［22］報道了一例L489S純合突變的非經典型患者，蛋白質三維結構模擬結果示L489S僅輕度改變了酶與底物的親和力。2010年，Parajes等［13］在非經典型患者中檢測到的M88I、P159L突變分別使酶活性下降至野生型的40%和25%。而研究顯示，引起經典型11β－OHD的CYP11B1突變通常使酶活性下降至5%以下或使酶活性完全喪失，但對于每個特定突變，其與患者臨床表現的嚴重程度無明顯相關性，攜帶相同基因突變的不同患者，可有輕度或重度高血壓，雄激素過多的表現也輕重度不等。因此，基因型與表型之間的相關性，尚有待進一步研究。

綜上所述，11β－OHD為CAH第二常見類型，它是由CYP11B1基因突變引起的常染色體隱性遺傳病，男性化和高血壓為經典型患者主要的臨床表現。目前，有關CYP11B1基因突變位點的報道已達70余種，基因突變對酶活性影響的研究也逐步深入。盡管研究發現非經典型患者的CYP11B1基因突變對酶活性的影響相對較小，但對于某個特定CYP11B1基因突變，其與患者臨床表現的嚴重程度無明顯相關性。對CYP11B1基因突變及其功能的深入研究，將有助于進一步揭示基因型與表型的關系，同時也為產前診斷及遺傳咨詢提供重要的依據，以提高嬰兒的優生優育水平。

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