FKBP52在反復體外受精種植失敗患者種植窗期子宮內膜的表達研究

譚真，彭麗英，朱文杰，賴寶玲，付志紅，李雪梅，唐雪蓮

（南方醫科大學附屬深圳市婦幼保健院，深圳 518048）

提高胚胎種植率是體外受精（IVF）助孕技術的一大挑戰。胚胎質量和子宮內膜容受性是影響胚胎種植的兩大重要因素，尋求預測與評估子宮內膜對胚胎容受性的客觀方法，有助于減少胚胎移植的盲目性［1］。近年來使用基因芯片和蛋白質組學技術描繪了胚胎種植窗期人子宮內膜的基因和蛋白的表達圖譜，為使用生化標志物預測種植期子宮內膜容受性提供了有利條件。

已有研究發現，FKBP52與孕激素受體（PR）結合能大大提高孕酮（P）與PR的親和力，增強PR活性，尤其是種植窗期FKBP52在子宮內膜組織的表達呈現時空特異性［2－3］。Tranguch等［4－5］發現，FKBP52基因敲除小鼠胚胎植入完全失敗，提示FKBP52是影響胚胎植入和子宮內膜容受性的非常重要的蛋白。目前國內外對FKBP52的研究主要集中在動物實驗方面，且FKBP52在種植期的細胞定位和定量表達尚不明確。本研究檢測FKBP52蛋白在人子宮內膜的表達情況，探討其與人子宮內膜容受性之間的關系，為臨床提高胚胎種植率提供理論基礎和實驗依據。

資料與方法

一、研究對象

選擇2013年8月至2014年3月在我院生殖中心接受體外受精－胚胎移植（IVF－ET）治療、連續3周期并移植至少6個優質胚胎仍未獲得臨床妊娠者20例（研究組）。同期募集正常女性志愿者15例（對照組），要求其近年有正常生育史，無卵巢手術史，3個月內無激素治療及宮腔操作史；無子宮內膜異位癥、輸卵管積水、子宮肌瘤、子宮腺肌瘤或多囊卵巢綜合征等疾病。所有參與者年齡25～35歲，月經規律，基礎內分泌正常，B超顯示正常子宮形態，卵泡晚期內膜三線征明顯，厚度≥8mm。本研究經本院倫理委員會批準，所有參與者簽署知情同意書。

二、研究方法

1.監測排卵和分組：入組者于月經第10天開始陰道B超監測卵泡發育，至卵泡直徑達15mm以上時，每天檢測卵泡大小及尿黃體生成素（LH）峰監測排卵，尿LH峰日為卵泡晚期，排卵＋7d為種植窗期，收取研究組婦女種植窗期子宮內膜標本（組1），并分別收取對照組卵泡晚期（組2）和種植窗期（組3）的子宮內膜標本。

2.標本采集和處理方法：用直徑0.3cm的內膜取樣器（GYNETICS，比利時）采集子宮腔中段內膜標本，置于4℃生理鹽水，洗去血污，干紗布塊吸去水分后分成2份：1份迅速放入－80℃冰箱中保存，用于實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT－PCR）檢測；1份放入4%甲醛中固定，用于免疫組織化學測定，同日抽血測定血清雌二醇（E2）和孕酮（P）水平。

3.RT－PCR檢測：采用 Trizol試劑盒（Invitrogen，美國）提取子宮內膜組織總RNA，并測量其RNA濃度及純度，控制A260／A280在1.8～2.0范圍。采用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒（Fermentas，加拿大）進行逆轉錄，取總RNA 2μg，OligodT18 1μl逆轉錄，反應總體積20μl。FKBP52引物序列：上游 5′－CATTGCCATAGCCACCATGAA－3′，下游5′－TCCAGTGCAACCTCCACGATA－3′，擴增產物長度252bp。同時以GAPDH為內參，其引物序列上游為5′－CAAGGTCATCCATGACAACTTTG－3′，下游為5′－GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG－3′，擴增產物長度475bp，引物均由南京金思瑞公司合成。PCR反應條件：95℃3min預變性，94℃20s變性，59℃20s退火，72℃30s延伸，共40個循環。監測記錄數據，自動計算軟件融點曲線分析，采用ABI7300型PCR儀（ABI，美國）檢出結果。按下列公式計算樣本中FKBP52mRNA 的相對表達量［6］：△Ct（目的基因）＝Ct（目的基因）－Ct（內參基因）；△△Ct＝△Ct（待測樣本）－△Ct（參照樣本）；目的基因的相對表達量為2－△△Ct。

4.免疫組織化學檢測：標本按常規脫水、透明、浸蠟后進行包埋成石蠟塊。采用鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連接法（SP法）檢測FKBP52蛋白的表達及定位。操作方法按SP法試劑盒（北京中杉金橋）說明書進行。石蠟切片厚3μm，常規脫蠟、水化、封閉，滴加一抗。一抗為兔抗人FKBP52多克隆抗體（Abcam，英國），工作稀釋度1∶100，4℃冰箱過夜。再滴加羊抗兔IgG（SP－9001，北京中杉金橋）二抗，3，3′－二氨基聯苯胺（DAB，武漢博士德）顯色，蘇木素復染、脫水、中性樹膠封片。陽性表達為細胞核或細胞漿染成黃色或棕黃色。陰性對照用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗。每張切片在顯微鏡（Olympus，日本）下隨機選取互不重復的5個視野（×400倍），采用Image－proplus6.0軟件對圖像進行分析，測定每個視野的積分光密度值（IOD），求其平均值，記為FKBP52蛋白的表達量。

三、統計學處理

結 果

一、各組的一般情況比較

對照組（組2、3）和研究組（組1）的平均年齡、體重指數（BMI）、月經周期、基礎的卵泡刺激素（FSH）、LH、E2、P、泌乳素（PRL）和睪酮（T）及黃體期的E2、P水平比較，差異均無統計學意義（P分別為 0.463、0.618、0.809、0.404、0.328、0.504、0.517、0.660、0.187、0.664和0.305）（表1）。

表1 對照組和研究組的一般情況（±s）

表1 對照組和研究組的一般情況（±s）

組 別 例數 平均年齡（歲） BMI（kg／m2） 月經周期（d）基礎性激素水平FSH（U／L） LH（U／L）對照組 15 32.7±2.9 21.91±2.63 31.0±3.7 7.48±1.63 4.53±1.77研究組 20 33.3±3.1 22.17±2.40 31.3±3.0 7.79±1.44 4.05±1.64組 別 例數基礎性激素水平 黃體期激素水平E2（pmol／L） P（nmol／L） PRL（nmol／L） T （nmol／L） E2（pmol／L） P（nmol／L）對照組 15 179.93±65.40 2.38±1.49 9.88±3.30 1.25±0.45 859.37±200.57 70.31±26.09研究組 20 157.97±77.96 2.16±1.43 15.46±7.71 1.39±0.45 811.42±278.49 60.77±20.26

二、FKBP52mRNA的表達情況

在實驗過程中，采用RT－PCR檢測，在三組中均有FKBP52mRNA表達，FKBP52基因和內參基因GAPDH的溶解曲線峰均為特異的單峰，熔點溫度（波峰對應的溫度）分別為85.7℃和88.5℃，表明擴增產物有特異性。組1的平均FKBP52mRNA表達水平低于組3，組2的FKBP52mRNA表達值亦低于組3，但三組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2 不同組FKBP52mRNA表達量及蛋白IOD值結果（±s）

表2 不同組FKBP52mRNA表達量及蛋白IOD值結果（±s）

注：與組3比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 例數 FKBP52mRNA FKBP52蛋白IOD值1 20 1.85±1.01 2 125.9±1 729.9＊2 15 2.29±2.13 1 360.2±853.7＊＊3 15 3.38±3.14 8 319.7±5 873.8

三、FKBP52蛋白的表達及定位情況

免疫組織化學結果顯示，FKBP52蛋白主要表達于子宮內膜腺上皮的胞核及胞漿，間質細胞表達極少。組1以胞核表達明顯（圖1A），組2以胞漿表達明顯（圖1B），組3中胞核及胞漿均表達明顯（圖1C）。Image－proplus6.0軟件圖像分析結果，組3的平均IOD值顯著大于組1（P＜0.05）和組2（P＜0.01）（表2）。

四、FKBP52mRNA及蛋白的表達與黃體期E2、P的關系

統計學分析結果顯示：子宮內膜FKBP52 mRNA的表達與雌、孕激素水平無相關性（r＝0.340，P＝0.436；r＝0.201，P＝0.413），FKBP52蛋白的表達與雌、孕激素水平也無相關性（r＝0.283，P＝0.367；r＝0.240，P＝0.394）（表3）。

圖1 FKBP52蛋白在3組的表達情況（SP法＋蘇木素復染 ×400）

表3 種植窗期FKBP52表達量與E2、P的關系

討 論

在IVF－ET過程中，常常好的胚胎質量、好的內膜、好的激素水平情況下仍然會發生不明原因的反復種植失敗，而對之臨床上依然缺乏有效的解決手段。近年來從分子生物學角度探尋其中關鍵基因和蛋白質以作為標志物，旨在指導臨床成為目前研究的熱點。

自1985年第1次發現FKBP52蛋白以來，越來越多的研究者重視FKBP52的研究。Lebeau等［7］研究發現，從兔肝臟中克隆出FKBP52的cDNA序列，能使FKBP52結合甾體激素受體，調節激素受體功能，增強轉導信號通路。Dey等［8］研究發現，缺少PR的小鼠可見排卵、受精和種植失敗，但在FKBP52基因敲除的小鼠僅由于缺乏子宮內膜容受性而引起種植失敗。采用蛋白質組學技術研究，發現人子宮內膜FKBP52在“種植窗”前期和“種植窗”期的表達存在差異［9］。FKBP52在子宮內膜對胚胎容受性起著重要作用，不管動物還是人類，相繼得到了證明。本實驗旨在對反復體外受精種植失敗患者子宮內膜上FKBP52的表達的相關因素進行研究，以正常婦女“種植窗”前期和“種植窗”期為對照，發現“種植窗”前期和“種植窗”期FKBP52蛋白均有表達，其主要表達于子宮內膜腺上皮的胞核及胞漿，間質細胞幾乎無表達。文獻報道，胚胎植入過程中FKBP52首先定位于胞漿，與PR結合形成復合物，再由胞漿內的動力蛋白快速轉運到胞核與P結合調節多種基因的表達［10］。本研究顯示，正常婦女子宮內膜FKBP52蛋白于胞漿和胞核均有表達，與文獻［10］報道一致；而反復體外受精種植失敗患者種植窗期FKBP52蛋白的表達僅定位于胞核，有別于正常的定位模式，或許這是不能成功種植的原因之一。

本組免疫組化結果還顯示，反復體外受精種植失敗患者子宮內膜FKBP52蛋白的表達顯著低于正常育齡婦女，差異有統計學意義（P＜0.05）。胚胎種植是一個非常復雜的動態過程，這一過程在特定的時空范圍內發生，即“種植窗”。種植窗期一系列細胞因子、生長因子和轉錄因子等復雜而又精確的定位和變化以及胚胎與子宮內膜容受性之間非常縝密的對話機制是胚胎成功植入的關鍵［11］。本研究結果提示，反復體外受精種植失敗患者子宮內膜FKBP52蛋白的異常定位及低表達可能影響了胚胎與子宮內膜之間的精密對話，從而導致種植失敗，但其具體影響機制尚不清楚，還有待進一步研究。RT－PCR檢測結果與免疫組化結果相一致，從不同側面反映了FKBP52表達與子宮內膜容受性的緊密相關性，推測FKBP52表達異常是胚胎種植失敗的重要相關因素。而FKBP52表達與血清雌孕激素高低無顯著相關性，今后應加大研究的樣本量，并需進一步闡明子宮內膜雌孕激素受體與FKBP52蛋白表達之間關系，以對結論作進一步驗證。

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