棉蚜吡蟲啉、啶蟲脒不同品系解毒酶活性測定和增效劑作用的研究

郭天鳳，史雪巖，高希武，劉曉寧

(1.中國農業大學昆蟲系，北京100193，2.新疆生產建設兵團第七師農科所，新疆奎屯 833200;3.新疆大學生命科學與技術學院，新疆生物資源與基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

棉蚜Aphis gossypii 寄主范圍廣泛，世代周期短，繁殖率高，世代重疊，有無性生殖和有性生殖兩種生殖方式，在棉花生長季節主要營孤雌生殖，屬于r-對策害蟲。目前對棉蚜具有較好防治效果的殺蟲藥劑主要是新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉和啶蟲脒等。近幾年來，隨著吡蟲啉和啶蟲脒的廣泛使用，棉蚜對吡蟲啉和啶蟲脒的抗藥性問題，引起了普遍的關注。

在靶標抗性、穿透抗性以及代謝抗性等多種昆蟲的抗藥性機制中，昆蟲解毒酶代謝能力增強所導致的代謝抗性是昆蟲對殺蟲藥劑產生抗性的重要機制之一(邢劍飛等，2010)。昆蟲體內的羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)以及多功能氧化酶(MFO)等作為重要的解毒酶，其活性的增加及變化是導致昆蟲抗藥性產生的主要原因。

增效劑是生物解毒代謝酶的有效抑制劑，如增效醚(PBO)是昆蟲體內多功能氧化酶(MFO)的抑制劑，順丁烯二酸二乙酯(DEM)是谷胱甘肽轉移酶的特異性抑制劑，磷酸三苯酯(TPP)是酯酶(Est)的專一性抑制劑。在殺蟲藥劑中添加適量的增效劑后，可對害蟲中解毒代謝酶產生抑制作用，從而顯著提高殺蟲劑的殺蟲效果。增效劑的使用，對于減少殺蟲藥劑的用量，降低生產和使用殺蟲劑成本，以及降低殺蟲藥劑的抗性風險，對害蟲的抗藥性進行有效的治理，均十分重要(陳召亮等，2007)。

昆蟲對殺蟲藥劑的代謝抗性與昆蟲體內多種解毒酶的活性變化具有密切的關系。為了有效延緩棉蚜對吡蟲啉和啶蟲脒抗性的產生，保證吡蟲啉和啶蟲脒在棉蚜防治中的長期有效使用，掌握棉蚜解毒代謝酶活性變化與其對吡蟲啉和啶蟲脒抗性形成之間的關系，具有重要的意義。因此，本工作在室內篩選了棉蚜抗、感吡蟲啉及啶蟲脒品系的基礎上，比較了棉蚜吡蟲啉、啶蟲脒抗性品系和敏感品系的羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-轉移酶 (GSTs)和細胞色素 P450sO-脫乙基(ECOD)酶的比活力差異，對棉蚜抗吡蟲啉和啶蟲脒的生物化學機制進行了初步研究。同時，為了掌握各種解毒酶變化在棉蚜對吡蟲啉抗性形成中的作用，本工作通過分別使用酯酶、P450 單加氧酶和谷胱甘肽S-轉移酶的抑制劑TPP、PBO 和DEM為增效劑，研究了增效劑在吡蟲啉、啶蟲脒對棉蚜抗、感品系毒力中的增效作用，為使用吡蟲啉、啶蟲脒，以及結合增效劑進行抗性棉蚜治理，提供了必要的研究數據。本研究對于制定合理有效的棉蚜抗性治理措施，具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

SP-2000UV 型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司);數顯恒溫水浴鍋(北京市醫療設備總廠);5417C/R 型臺式高速冷凍離心機(Eppendorf，Germany);YKH-I 型液體快速混合器(江西醫療器械廠);HZQ-C 型空氣浴恒溫振蕩器(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司);LS55 Luminescence Spectrometer 熒光分光光度計(Perkin Elmer)

1.2 試蟲來源、藥劑及來源

試蟲來源:

實驗室篩選的吡蟲啉抗性和敏感品系(抗性倍數是83.27 倍);

實驗室篩選的啶蟲脒抗性和敏感品系(抗性倍數是82.33 倍)。

藥劑及來源:

96.0%吡蟲啉原藥和98.5%啶蟲脒原藥(山東聯合化工廠股份有限公司生產);

α-乙酸萘酯(α-naphthyl acetate，α-NA)，毒扁豆堿(eserine)，由Fluka 公司提供;1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2，4-dinitrobezene，CDNB)，1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2，4-dinitrobezene，CDNB)，還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)，二硫蘇糖醇(1，4-Dithiothreitol，DTT)，7-乙氧基香豆素 (7-ethoxycoumarin，7-EC)，苯甲基 磺酰氟(phenylmethylsulfonyl，PMSF)，考馬斯亮藍(coomassie brilliant blue G-250)，固藍B 鹽(fast blue B salt)，十二烷基硫酸鈉 (sodium dodecyl sulfate，SDS)，牛血清蛋白(bovine serum albumi，BSA)，由美國Sigma 公司提供;乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、甘油(glycerol)、KH2PO4及Na2HPO4均為分析純，由北京化學試劑公司提供;98%增效醚(piperonyl buoxide，PBO)，由美國Chem Service 公司提供;順丁烯二酸二乙酯 (Diethyl maleate，DEM)，由美國Chem Service 公司提供;磷酸三苯酯(Triphenylphosphate，TPP)，由美國New Jersey 公司提供。

1.3 吡蟲啉、啶蟲脒對棉蚜毒力生物測定

吡蟲啉、啶蟲脒對棉蚜的毒力測定，仿Moores 等(1996)的方法進行，并加以改進。

1.4 增效劑試驗

首先測定獲得PBO、DEF、DEM 對抗性和敏感品系棉蚜無致死作用的最高濃度 (分別為100 mg/L，50 mg/L 和50 mg/L)，以確保對照組的對照效果。然后采摘種植的非轉基因無蟲棉花葉片，用打孔器將棉花葉片打孔。將其浸入無致死的最高濃度增效劑中浸30 s 后取出，置陰涼通風處晾干，放入底層鋪有1 mL 1%瓊脂凝膠的燒杯中。用毛筆小心將無翅成蚜接入葉片上，飼養12 h 后，將此經增效劑處理的棉蚜按1.3的方法，進行吡蟲啉、啶蟲脒對棉蚜毒力的生物測定。增效值用Bradford (1976)的方法計算增效比，(SR)=單一藥劑對棉蚜的LC50值/藥劑對增效劑處理的棉蚜的LC50值。

1.5 棉蚜中3 種解毒酶比活力的測定

1.5.1 棉蚜羧酸酯酶活性測定

(1)酶液制備:挑取抗性、敏感無翅成蚜300頭，加入1 mL 0.4 M 磷酸緩沖液，充分勻漿，10080 rpm 離心15 min，取上清液作為母液，重復3 次，-80℃冷凍保存。

(2)活性測定:參照Van Aspern (1962)的方法并加以修改。取3 只試管，在每個試管中依次加入0.45 mL 磷酸緩沖液(0.04 M，pH7.0)、1.8 mL 3×10-4M α-NA (α-NA:毒扁豆堿1∶1)、0.05 mL 酶液。30℃反應15 min 后，加入顯色劑(1%固藍B 鹽:5%SDS，2∶5 顯色劑)終止反應并顯色，靜置5-10 min 后在600 nm 下測定吸光值。對照管中不加酶液，于加入顯色劑之后補加0.05 mL 酶液。每個處理重復三次，每個重復三次測定。根據得出的吸光值(OD)平均值和測得的酶液的蛋白含量，求出羧酸酯酶的比活力。

1.5.2 棉蚜谷胱甘肽S-轉移酶比活力測定

(1)酶液制備:稱取約50-60 mg 棉蚜成蟲，于冰浴中加入2 mL pH6.5的磷酸緩沖液進行勻漿，10000 g 4℃下離心30 min，取上清作為粗酶液，重復3 次，-80℃凍存備用。

(2)活性測定:參照Habig 等(1981)方法進行。反應體系總體積為900μL，依次加入pH 6.5的磷酸緩沖液0.64 mL、0.03 mL 30 mM 還原型谷胱甘肽(GSH)作底物、粗酶液0.2 mL 及0.03 mL 30 mM 1-氯-2，4-二硝基 苯(CDNB)，于340 nm 波長下記錄2 min 內的吸光值變化。每個實驗設三次獨立重復，每次重復平行測定三次。根據得出的吸光值(OD)平均變化值和測得的酶液的蛋白含量，求出谷胱甘肽S-轉移酶的比活力。

1.5.3 細胞色素P450-O-脫乙基比活力測定

(1)酶液制備:稱取約200 mg 棉蚜成蟲，冰浴勻漿，勻漿液為pH7.5 磷酸緩沖液(含0.4 M DTT、0.4 M PMSF、20%甘油)。10000 g 4℃下離心約20 min，取上清作為粗酶液，并用7-8 層濾紙過濾后立即用于反應測定。

(2)活性測定:主要參照Aitio (1978)的方法測定棉蚜7-乙氧基香豆素O-脫乙基(ECOD)比活力。在650μL 0.1 M pH7.0 Tris-HCl 緩沖液中，加入底物6μL 10 mM 7-乙氧基香豆素，加入6μL 12 mM NADPH 以啟動反應，加入粗酶液250μL。于35℃下反應15 min，加入15% TCA 300μL終止反應后，加入450μL Gly-NaOH。用熒光分光光度計測定酶反應產物7-羥基香豆素的熒光值。檢測條件:發射光波長456 nm，激發光波長368 nm。每個實驗設三次獨立重復，每次重復平行測定三次。

1.6 數據統計與分析

所得數據用POLO 軟件(LeOra Software Inc.，California，USA)或SAS 軟件計算毒力回歸方程的斜率值(Slope ±SE)，LC50及其95%置信限及卡方值等。采用EXCEL 軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 TPP、PBO 和DEM 在吡蟲啉敏感和抗性棉蚜品系中對吡蟲啉毒力的增效比

從表1 可知，吡蟲啉對棉蚜吡蟲啉敏感和抗性品系的LC50分別為0.176 和14.657 mg/L。TPP、PBO 和DEM 在吡蟲啉敏感品系中對吡蟲啉毒力的增效比分別為1.12、1.09、0.97，而在吡蟲啉抗性品系中的增效比分別為2.02、1.75、1.05，可見，除DEM 外，TPP 和PBO 在棉蚜吡蟲啉敏感和抗性品系中對吡蟲啉的毒力均有明顯的增效作用，且在抗性品系中的增效作用顯著高于敏感品系，其中TPP 對抗性棉蚜的增效比大于2。

表1 增效劑PBO、DEM、TPP 在吡蟲啉敏感SS 和抗性RR 棉蚜品系中對吡蟲啉毒力的增效作用Table 1 Synergistic effects of PBO，DEF and TPP on imidacloprid in the SS and RR stains ofcotton aphid (Aphids gossypii)

2.2 TPP、PBO 和DEM 在啶蟲脒敏感和抗性棉蚜品系中對啶蟲脒毒力的增效比

從表2 可以看出，啶蟲脒棉蚜啶蟲脒敏感和抗性品系的LC50分別為0.18 和14.819 mg/L。TPP、PBO 和DEM 在啶蟲脒敏感棉蚜品系中對啶蟲脒毒力的增效比僅為1.02、1.03、1.02，在啶蟲脒抗性棉蚜品系中對啶蟲脒毒力的增效比為1.77、1.61、1.04，可見，除DEM 外，TPP 和PBO 在棉蚜啶蟲脒敏感和抗性品系中對啶蟲脒的毒力均有明顯的增效作用，且在抗性品系中的增效作用顯著高于敏感品系，其中TPP 對抗性棉蚜的增效比大于1.77。

2.3 吡蟲啉、啶蟲脒抗性品系和敏感品系棉蚜中解毒酶比活力比較

從表3 可以看出，吡蟲啉抗性品系和敏感品系棉蚜的羧酸酯酶活性差異非常顯著，棉蚜抗吡蟲啉品系的羧酸酯酶活性是敏感品系的3.26 倍。說明棉蚜對吡蟲啉的抗性形成與羧酸酯酶活性的增強有關。抗吡蟲啉棉蚜品系的細胞色素P450-O-脫乙基酶活性是敏感品系的1.60 倍，表明棉蚜對吡蟲啉的抗性形成與棉蚜細胞色素P450s O-脫乙基活性的增加具有一定的關系。抗吡蟲啉棉蚜品系的谷胱甘肽S-轉移酶活性是敏感品系的1.08 倍，表明棉蚜對吡蟲啉的抗性形成與棉蚜谷胱甘肽S-轉移酶的關系不大。

表2 增效劑PBO、DEM、TPP 在敏感SS 和抗性RR 棉蚜品系中對啶蟲脒毒力的增效作用Table 2 Synergistic effects of PBO，DEF and TPP on acetamiprid in the SS and RR stains of cotton aphid (Aphids gossypii)

表3 吡蟲啉抗性和敏感棉蚜品系3 種解毒酶比活力的比較Table 3 Activities of the detoxification enzymes from susceptible and resistance strains of Aphis gossypii to imidacloprid

表4的結果可以看出，啶蟲脒抗性品系和敏感品系棉蚜的羧酸酯酶活性差異非常顯著，棉蚜抗啶蟲脒品系的羧酸酯酶活性是敏感品系的2.91 倍，棉蚜對啶蟲脒的抗性形成與羧酸酯酶活性的增強有關。抗啶蟲脒棉蚜品系的細胞色素P450-O-脫乙基酶活性是敏感品系的1.69 倍，表明棉蚜對啶蟲脒的抗性形成與棉蚜細胞色素P450s O-脫乙基活性的增加具有一定的關系。抗啶蟲脒棉蚜品系的谷胱甘肽S-轉移酶活性是敏感品系的1.04 倍，表明棉蚜對啶蟲脒的抗性形成與棉蚜谷胱甘肽S-轉移酶的關系不大。

表4 啶蟲脒抗性和敏感棉蚜品系3 種解毒酶比活力的比較Table 4 Activities of the detoxification enzymes from susceptible and resistance strains of Aphis gossypii to acetamiprid

3 討論與結論

本研究利用室內篩選獲得的吡蟲啉、啶蟲脒抗性和敏感品系，研究了增效劑的增效作用，發現TPP 和PBO 在吡蟲啉和啶蟲脒敏感品系棉蚜中增效作用不明顯，但在抗性品系中的增效作用顯著。TPP 和PBO 在吡蟲啉抗性品系棉蚜中的增效比為2.02 和1.75，在啶蟲脒抗性品系棉蚜中的增效比為1.77 和1.61。可見，羧酸酯酶及細胞色素P450 酶活性的變化是棉蚜對吡蟲啉及啶蟲脒產生抗性的主要原因之一。

在殺蟲劑的選擇壓力下，昆蟲羧酸酯酶產生了相應的進化的反應，導致抗性昆蟲中羧酸酯酶活性有所增高，是一種重要的抗性機制。如昆蟲中羧酸酯酶活性增高，引起了害蟲對有機磷殺蟲劑抗性的產生。這些在庫蚊Culex (Hemingwayetal et al.，2004)，褐飛虱Nilaparvata lugens (Small and Hemingway，2000)，桃蚜Myzus persicae (Field et al.，1999)，棉蚜Aphis gossypii Glover (Cao et al.，2008;Pan et al.，2009)，東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis (Zhang et al.，2011)中都有發現。本研究結果表明，棉蚜吡蟲啉、啶蟲脒抗性品系和敏感品系的羧酸酯酶活性差異非常顯著。棉蚜抗性吡蟲啉和啶蟲脒品系的羧酸酯酶活性是敏感品系的3.26 和2.91 倍。因此，棉蚜對吡蟲啉、啶蟲脒的抗性形成與其羧酸酯酶活性的增強，也有著非常密切的關系。

P450 單加氧酶活力升高是多種害蟲對吡蟲啉產生抗性的普遍機制，在多種抗吡蟲啉害蟲中均有發現。細胞色素P450 單加氧酶是參與外源性化學物質包括殺蟲劑解毒的重要代謝酶系。細胞色素P450 單加氧酶活性的提高，增強了昆蟲對擬除蟲菊酯和新煙堿類殺蟲劑的抗藥性，這種抗性機制在淡色庫蚊Culex pipiens pallens、德國小蠊Blattella germanica、小菜蛾Plutella xyllostella、煙粉虱Bemisia tabaci、赤擬谷盜Tribolium castaneum Herbst、桃蚜Myzus persicae的研究中均有報道(Shen et al.，2003;Pridgeon et al.，2003;Bautista et al.，2009;Karunkeretal et al.，2008;Zhu et al.，2010;Puinean et al.，2010)。

細胞色素P450 單加氧酶通過降低殺蟲劑的殺蟲效果，而表現為害蟲對有機磷殺蟲劑抗性的產生。如Sato 等 (2001，2007)報道了細胞色素P450 單加氧酶的氧化代謝機制，是捕食性鈍綏螨對殺撲磷抗性的產生的機制。家蠅CYP6A1 基因轉錄的增加，導致了其對殺蟲劑二嗪農抗性的產生(李芬等，2012)。本研究表明，棉蚜對吡蟲啉、啶蟲脒抗性品系的細胞色素P450-O-脫乙基酶的活性顯著高于敏感品系，分別是敏感品系的1.60 倍和1.69 倍，說明細胞色素P450-O-脫乙基酶的活性升高，也會降低吡蟲啉和啶蟲脒殺蟲效果，從而引發棉蚜抗性的產生。

吡蟲啉、啶蟲脒抗性棉蚜品系中羧酸酯酶活性、細胞色素P450-O-脫乙基酶活性，均明顯高于敏感品系。增效劑的增效作用實驗和解毒酶活力比較表明，羧酸酯酶和多功能氧化酶在棉蚜對吡蟲啉、啶蟲脒抗性產生中，發揮了重要作用，谷胱甘肽-S-轉移酶僅起到了一定輔助作用。在棉花生產中，應繼續利用農業、生物、物理防治等相結合的綜防技術，交替使用作用機制不同的殺蟲劑，利用增效劑對酯酶和P450 單加氧酶活性產生的抑制作用，加入增效劑來提高防治效果，減少農藥的使用量和使用次數并延緩其抗藥性發展。

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