刺桐姬小蜂成癭過程中蟲癭內幾種酶的活性變化

汪少妃，袁 毅，劉建強，朱 麟

(海南師范大學生命科學學院，海南省動植物生態學省部共建實驗室，海口 571158)

刺桐姬小蜂Quadrastichus erythrinae Kim 隸屬膜翅目Hymenoptera，姬小蜂科Eulophidae，嚙小蜂亞科Tetrastichinae，胯姬小蜂屬Quadrastichus，是2004年新發現的一種檢疫性入侵害蟲(焦 懿等，2006)。主要分布在毛里求斯、留尼汪、新加坡(Kim et al.，2004)、中國臺灣(Yang，2004)和中國廣東省的深圳與廣州、福建省的廈門、海南省的三亞與萬寧等地(黃蓬英等，2005)。刺桐姬小蜂是一種重要的致癭害蟲，專一為害刺桐屬Erythrina spp.的植物。成蟲喜歡在刺桐的嫩枝、幼嫰的葉柄和葉片上產卵并誘導植物形成蟲癭，卵、幼蟲及蛹的發育均在蟲癭內完成(陳志麟等，2006)。蟲癭是由造癭昆蟲產卵或幼蟲取食時一些分泌物的刺激后，而造成植物細胞加速分裂和異常分化形成的畸形瘤狀物或突起 (Stone and Schonrogge，2003)。蟲癭的發育可分為初始形成期、成長分化期、成熟期和開裂期4個階段(Lalonde and Shorthouse，1984)。蟲癭形成過程中會導致植物產生一系列的生理生化反應(楊曼妙，2007)，導致營養物質和次生物質含量改變，及保護酶活性變化(朱麟和古德祥，1999)。由于刺桐姬小蜂是近年入侵我國的檢疫性害蟲，國內研究主要集中在生物學特性和危害防治方面(Kim et al.，2004;Yang，2004;黃蓬英等，2005;楊偉東等，2005;陳志麟等，2006;焦懿等，2006;楊義標等，2006;耿曉紅，2008)，關于刺桐姬小蜂危害后，寄主葉片生理變化未見報道。本文對刺桐姬小蜂為害形成蟲癭四個不同階段的保護酶活性進行了測定，分析了蟲癭不同階段保護酶活性變化規律，探討寄主植物對刺桐姬小蜂蟲癭形成產生的抗性反應，研究結果對于探討蟲癭形成機制具有較重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試的寄主為盆栽的刺桐扦插苗，株高約50 cm，共計70 株。供試蟲源為刺桐姬小蜂，于海南省海口市采集刺桐姬小蜂危害的刺桐枝條，帶回實驗室待其羽化后接種。

1.2 方法

1.2.1 接種方法

1.2.2 酶活性測定

超氧化物歧化酶 (SOD)和過氧化氫酶(CAT)測定使用相關試劑盒，過氧化物酶(POD)的活性采用愈創木酚比色法測定(孔祥生和易現峰，2008)，多酚氧化酶(PPO)活性的測定采用比色法(紀淑娟等，2010)。對待測樣品進行相同的前期處理，準確稱取0.2 g 待測葉片，按重量體積比9 倍生理鹽水冰浴下勻漿，制成10%的勻漿液，3000 r/min，離心10 min，取上清液進行測定，酶液提取平行3 次，重復2 次。

SOD 活性測定:取對照管和測定管中分別加入雙蒸水、酶液和相關試劑，用漩渦混勻器混勻，置37℃水浴40 min 再加入顯色劑，雙蒸水調零，于波長550 nm 處比色，測OD 值，計算SOD 活性以U/mg prot為單位。

CAT 活性測定:按照CAT 試劑盒說明書規定先后在對照管和測定管中添加試劑和酶液，于405 nm處比色，測定各管OD 值，計算CAT 活性。

POD 活性測定:以愈創木酚為H2O2酶的底物，加入酶液，在470 nm 處測OD 值，以每分鐘吸光度變化0.01為1個POD 活性單位。

PPO 活性測定:取0.1 mol/L 鄰苯二酚1 mL加入4 mL pH6.1的磷酸緩沖液中，加入0.1 mL的酶液，于420 nm 處測定吸光度變化，每隔20 s 測一次，共測2 min。以每分鐘吸光度變化0.01為1個PPO 活性單位。

1.2.3 統計方法

采用SPSS16.0 for Windows 軟件計算原始數據的平均值和標準差，進行組間均值數據的One-Way ANOVA 方差分析，采用LSD 多重比較。

2 結果與分析

2.1 SOD 活性影響

由圖1 可知，對照組中SOD 活性隨發育表現逐漸減低，非蟲癭組織和蟲癭組織中SOD 活性呈上升、下降再上升的趨勢，從成長分化期開始隨受害程度加重蟲癭組織SOD 活性明顯高于對照組和非蟲癭組織，達到差異極顯著水平(P＜0.01)，特別是在開裂期是對照組的5.36 倍;在成熟期蟲癭組織和非蟲癭組織SOD 活性均明顯下降(P＜0.01);而非蟲癭組織相比對照無明顯變化，說明刺桐姬小蜂為害主要誘導蟲癭部位SOD 酶活性變化，對非蟲癭部位影響相對較小。

2.2 CAT 活性影響

CAT 酶活性變化趨勢(圖2)與SOD 相似，蟲癭組織中酶活性均高于對照組，且達到差異極顯著(P＜0.01)，在成熟期增加達到14.23倍;非蟲癭組織中CAT 活性先上升后下降，成長分化期為對照組的8.77 倍，達到差異極顯著(P＜0.01)，到成熟期CAT 活性有所下降，但仍顯著高于對照組(P＜0.05)。與SOD 酶活變化相似，CAT 活性的增加也主要體現在蟲癭組織中。

圖1 刺桐姬小蜂誘導的蟲癭不同發育階段SOD 活性Fig.1 The SOD activity of Erythrina variegate galls induced by Quadrastichus erythinae at different gall-developmental stages

圖2 刺桐姬小蜂誘導的蟲癭不同發育階段CAT 活性Fig.2 The CAT activity of Erythrina variegate galls induced by Quadrastichus erythinae at different gall-developmental stages

2.3 POD 活性影響

從圖3 可以看出，相比對照組POD 酶活性增加主要體現在非蟲癭組織上，且每個時期和對照相比顯著增加(P＜0.01);到開裂期為對照的2.16 倍;雖然蟲癭組織中POD 酶活性呈上升趨勢，但在前三個時期均顯著低于對照組(P＜0.05);而在開裂期蟲癭中的酶活為對照組2.66 倍，與非蟲癭組織比也達到差異極顯著水平(P＜0.01)。

2.4 PPO 活性影響

多酚氧化酶(PPO)可氧化酚類化合物，同時也是木質素的合成前體(毛愛軍，2003)，為植物抗性的重要酶指標。由圖4 可知，除初始形成期外，蟲癭組織和非蟲癭組織中的PPO 活性均比對照組要高，蟲癭組織中的酶活隨發育逐漸上升，到開裂期為對照的19.73 倍;各時期相比對照組和非蟲癭組織的PPO 酶活性均達到差異極顯著水平(P＜0.01);而成熟期非蟲癭組織比對照升高不顯著(P ＞0.05)。所以，在蟲癭的不同發育階段PPO 酶活性主要體現在蟲癭組織中。

圖3 刺桐姬小蜂誘導的蟲癭不同發育階段POD 活性Fig.3 The POD activity of Erythrina variegate galls induced by Quadrastichus erythinae at different gall-developmental stages

圖4 刺桐姬小蜂誘導的蟲癭不同發育階段PPO 活性Fig.4 The PPO activity of Erythrina variegate galls induced by Quadrastichus erythinae at different gall-developmental stages

3 結論與討論

正常情況下，細胞內的活性氧含量與保護酶系統之間處于動態平衡狀態(Prasad，1996)，一旦植物受到逆境脅迫，正常的氧代謝受阻，使得植物體內的活性氧含量會迅速積累，加速了膜脂過氧化作用從而導致膜系統受損，引起細胞膜的通透性增加及電解質的滲漏，最終會導致細胞死亡和組織被損壞，使得植物處于一種損傷狀態(Havlickova et al.，1996;程璐，2009)，而SOD、CAT、POD 和PPO 是細胞內防御系統中重要的保護酶。本試驗研究表明，受刺桐姬小蜂危害后受害葉片內保護酶(SOD、CAT、POD、PPO)活性顯著提高，說明刺桐姬小蜂蟲癭的形成誘導刺桐的保護酶產生，表現出了明顯的防御反應。

SOD的主要作用是清除O-2，同時產生歧化性產物H2O2;而CAT 在保護酶系中主要起到降解H2O2的作用(Prasad，1996)，能有效地阻止O-2和H2O2在植物體內的積累，防止自由基對細胞的毒害(張庭偉和劉長仲，2011)。本次試驗結構發現:SOD 和CAT 活性變化主要表現在蟲癭組織中;刺桐姬小蜂的刺激，導致植物體內O-2大量產生，使得蟲癭中SOD 活性迅速上升，到成熟期，由于刺桐姬小蜂化蛹取食活動的停止酶活性有所下降;CAT 主要還原SOD 作用的產物，所以其活性變化的趨勢和機理與SOD 相似。說明刺桐姬小蜂的取食活動與寄主植物生理生化變化相關。

POD 和PPO 可通過參與木質素的合成和細胞壁蛋白的交聯化作用來促進細胞壁進一步加厚，可以有效的防治其他生物的捕食和入侵(Gaspar et al.，1982;Macadam et al.，1992;Lamb and Dixon，1997;Allison and Schultz，2005;衛麥霞等，2008)。測試結果發現，PPO 活性在整個蟲癭發育階段呈上升趨勢，初期增加較緩，隨后逐步高于對照;PPO 作用提高了蟲癭組織的木質化程度，對生活在蟲癭內的蟲體起到一定的保護作用，與(王召元，2007;王洪濤，2011;呂文玲，2012)研究結果相似。而POD 活性在蟲癭組織中明顯比對照要低，這是刺桐抗蟲性較低的生理生化機制之一，也是造癭昆蟲與寄主植物協同進化的結果，這與李諾等(2010)對桉樹枝癭姬小蜂蟲癭研究結果一致。非蟲癭部分PPO 和POD 活性都顯著高于對照，可能是寄主通過增加蟲癭周圍組織細胞壁的厚度，來防止刺桐姬小蜂在葉片上的再次產卵，也是植物的一種自我保護作用。

本研究僅對刺桐姬小蜂危害后，刺桐葉片中不同時期這四種保護酶的變化。這些酶活性與刺桐姬小蜂的取食活動有關，同時也表現出了寄主植物的抗性作用。但對于植物整體防御機制可能還涉及到其他生理生化反應及分子水平上的調控機制等方面，仍需有待進一步研究。

References)

Allison SD，Schultz JC.Biochemical responses of chestnut oak to a galling cynipid ［J］.Journal of Chemical Ecology，2005，31(1):151-166.

Chen L.Studies on anti-aphis mechanism of alfalfa's biochemical indexes ［D］.Master Dissertation.Gansu:Gansu Agriculture University.2009，1-37.［程璐.苜蓿生理生化抗蚜機制初步研究［D］.碩士論文.甘肅:甘肅農業大學.2009，1-37］

Chen ZL，Yu DJ，Shao ZF，et al.Occurrence of erythrina gall wasp，Quadrastichus，and the prosess of the fall shaped ［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2006，43 (6):863-866.［陳志麟，余道堅，邵志芳，等.刺桐姬小蜂發生習性及其蟲癭形成分析［J］.昆蟲知識，2006，43 (6):863-866］

Gaspar T，Penel CL，Thorpe T，et al.A Survey of their Biochemical and Physiological Roles in Higher Plants［M］.Geneva，University of Geneva，1982.

Geng XH.Bionomics and ecology of theerythrinae gall wasp，Quadristichus erythrinae Kim［D］.Master Dissertation.Fuzhou:Fujian Agriculture and Forestry University.2008，1-50.［耿曉紅.刺桐姬小蜂生物學和生態學特性的研究［D］.碩士論文.福州:福建農林大學.2008，1-50］

Havlickova H，Cvikrova M，Eder J.Changes in the pattern of phenolic acids induced by aphid infest at ion in two winter wheat cultivars［J］.Bullet in OILB-SROP，1996，19 (5):106-110.

Huang PY，Fang YW，Huang J，et al.A new invasive alien species，Quadrastchus erythrinae，in mainland of China ［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2005，42 (6):731-732.［黃蓬英，方元煒，黃建，等.中國大陸一新外來入侵種一刺桐姬小蜂［J］.昆蟲知識，2005，42 (6):31-732］

Ji SJ，Yin JN，Li JZ.Properties and measurement of polyenol oxidase in flesh of Miyou pomelo fruits ［J］.Northern Horticulture，2010，(17):171-174.［紀淑娟，尹競男，李家政.蜜柚多酚氧化酶的酶學特性與活性測定研究［J］.北方園藝，2010，(17):171-174］

Jiao Y，Chen ZL，Yu DJ，et al.A new record genus and new record species of Eulophidae (Hymenoptera)in continental China［J］.Entomotaxonomia，2006，28 (1):69-74.［焦懿，陳志麟，余道堅，等.姬小蜂科中國大陸一新記錄屬一新記錄種［J］.昆蟲分類學報，2006，28 (1):69-74］

Kim IK，Delvare G，La SJ.A new species of Quadrastichus(Hymenoptera:Eulophidae):A gall-inducing pest on Erythrina spp.(Fabaceae)［J］.J.Hym.Res.，2004，13 (2):243-249.

Kong XS，Yi XF.Experiment Technology of Plant Physiology ［M］.Beijing:China Agricultural Scientech Press，2008.［孔祥生，易現峰.植物生理學實驗技術［M］.北京:中國農業出版社，2008］

Lalonde RG，Shorthouse JD.Developmental morphology of the gall of Urophora cardui (Diptera，Tephritidae)in the stems of Canada thistle (Cirsium arvense)［J］.Can.J Bot.，1984，62:1372-1384.

Lamb C，Dixon RA.The oxidative burst in plant disease resistance［J］.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，1997，48:251-275.

Li N，Wang MY，Luo JT，et al.Preliminary study on physiology and biochemistry characteristics of eucalyptus galls caused by Leptocybeinvasa［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2010，38 (8):4126-4127.［李諾，王美英，羅基同，等.桉樹枝癭姬小蜂蟲癭生理生化初步研究［J］.安徽農業科學，2010，38 (8):4126-4127］

Lv WL.Biological charzcteristics of Pseudophacopteron alstonium and its effects on the physiological and biochemical characteristics of the host plant ［D］.Master Dissertation.Guangxi:Guangxi University.2012，1-69.［呂文玲.鴨腳木星室木虱生物學特性及其對寄主生理生化的影響［D］.碩士論文.廣西:廣西大學.2012，1-69］

Macadam JW，Nelson CJ，Sharp RE.Peroxidase activity in the leaf elongation zone of tall fescue ［J］.Plant Physiol.，1992，99:872-878.

Mao AJ，Wang YJ，Feng LX，et al.Variation of polyphenoloxidase，peroxidase and phenylalanine ammonialyasa in hot pepper seedings infected by Phytophthora capsici L.［J］.Acta Agriculturae Boreali-Sinica，2003，18 (12):66-69.［毛愛軍，王永健，馮蘭香，等.疫病病菌侵染后辣椒幼苗體內保護酶活性的變化［J］.華北農學報，2003，18 (12):66-69］

Prasad TK.Mechanism of chilling-induced oxidative stress injury and tolerances in developing maize seedlings:changes in ant ioxidant system，oxidation of proteins and lipids and protease activities［J］.Plant Journal，1996，10 (6):1017-1026.

Stone GN，Schonrogge K.The adaptive significance of insect gall morphology［J］.Ecology and Evolution，2003，18 (10):512-522.

Wang HT.Effects of tobacco plants infested by Bemisia tabaci(Gennadius)B-biotype on the development and reproduction of Spodoptera litura (Fabricius)and its mechanism ［D］.Ph.D.dissertation.Shandong:Shandong Agricultural University.2011，1-95.［王洪濤.B 型煙粉虱取食誘導的煙草對斜紋夜蛾生長發育和繁殖的影響及機制［D］.博士論文.山東:山東農業大學.2011，1-95］

Wang SY.Study on physiological and biochemical basis of burl forming after inoculation with Agrobacterium tumefaciens into Populus tomentosa［D］.Master Dissertation.Hebei:Hebei Agricultural University.2007，1-36.［王召元.毛白楊接種根瘤農桿菌后癭木形成的生理生化基礎研究［D］.河北.河北農業大學.2007，1-36］

Wei MX，Gong DX，Li DJ，et al.Effect of Prochloraz，its formulation and major metabolites on the activities of SOD and POD in Lemna paucicostata ［J］.Journal of Agro-Environment Science，2008，27 (3):1072-1076.［衛麥霞，龔道新，黎定軍，等.咪鮮胺及其制劑和主要代謝物對三葉浮萍SOD 和POD 活性的影響［J］.農業環境科學學報，2008，27 (3):1072-1076］

Wu YH，Zhong LJ，Zhao XX.Relaionship among totalphenol，flavonoid and PPO activity with the necrosis of tobacco infected by PVYN［J］.Acta Pheytopa Thologica Sinica，2007，37 (4):398-402.［吳元華，鐘麗娟，趙秀香.煙草感染PVYN 后葉脈壞死與總酚、類黃酮及PPO 關系研究［J］.植物病理學報，2007，37 (4):398-402］

Yang MM.Gall—Insects and plants to dance ［J］.Scientific Development，2007，409:29-33.［楊曼妙.蟲癭——昆蟲與植物共舞［J］.科學發展，2007，409:29-33］

Yang MM，Tung GS，La SJ.Outbreak of Erythrina gall wasp(Hymenoptera:Eulophidae)on Erythrina spp.(Fabaceae)in Taiwan［J］.Plant Protection Bulletin，2004，46 (4):391-396.

Yang WD，Yu DJ，Jiao Y，et al.Occurrence，damage and quarantine of the erythrinae gall wasp［J］.Plant Protection，2005，31 (6):36-38.［楊偉東，余道堅，焦懿，等.刺桐姬小蜂的發生、危害與檢疫［J］.植物保護，2005，31 (6):36-38］

Yang YB，Shao ZF，Qiu SS，et al.Occurrence and damage of the erythrinae gall wasp in Shenzhen［J］.Plant Quarantne，2006，20(6):356-357.［楊義標，邵志芳，邱少松，等.深圳刺桐姬小蜂的發生與為害［J］.植物檢疫，2006，20 (6):356-357］

Zhang TW，Liu CZ.Influences of Rhopalosiphum padi on oxidases of three wheat seeding［J］.Plant Protection，2011，37 (4):72-75.［張庭偉，劉長仲.禾谷縊管蚜對三個小麥品種幼苗保護酶的影響［J］.植物保護，2011，37 (4):72-75］

Zhu L，Gu DX.The contemporary implication of the concept of insect resistance of plants ［J］.Entomological Knowledge，1999，36(6):355-360.［朱麟，古德祥.植物抗蟲性概念的當代內涵［J］.昆蟲知識，1999，36 (6):355-360］