水皰性口炎病毒兩血清型G蛋白的截短表達和間接ELISA方法的建立

臧京帥，高志強，張樂萃，張鶴曉

（1.青島農業(yè)大學動物科技學院，山東 青島 266109；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 朝陽 100026）

水皰性口炎（Vesicular stomatitis,VS）是由水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）引起的動物病毒性傳染病，VSV可感染馬及其他多種動物，其中馬的易感性最強。其臨床特征為短期發(fā)熱，口腔黏膜、乳頭上皮、趾間及蹄冠部出現丘疹和水皰[1]。人偶發(fā)感染，以流感癥狀為主。水皰性口炎病毒屬于彈狀病毒科水皰性病毒屬，為負鏈RNA有囊膜病毒。根據病毒的抗原性，可將VSV分成兩個血清型，即新澤西型（VSV-NJ）和印第安那型（VSV-IND）；但這2個血清型的病毒在結構基因組成、轉錄調控和病毒蛋白等方面均相同[2]。由于我國還沒有該病發(fā)生和流行的報道，故將其列為外來病，在進出境動物檢疫對象中被列為二類病。該病毒是通過糖蛋白G吸附于敏感細胞表面受體磷酰絲氨酸（PS）而開始感染。如果利用蛋白酶去掉G蛋白，可使病毒的感染性大幅度降低，但一旦將完整的G蛋白重新加入無包膜突起的病毒粒子中，又可恢復其感染性[3]。

在進出口動物檢疫中，對于水皰性口炎病毒抗體檢測，目前采用的方法為中和試驗（VN），液相阻斷ELISA（LP-ELISA）和補體結合試驗（CF）。其中VN生物安全要求較高，且檢測周期長；LP-ELISA和CF操作相對繁瑣。由于VSV-NJ和VSVIND僅有部分交叉反應，因此在采用LP-ELISA檢測抗體時需要將兩種血清型的抗原等量混合后檢測抗體。

本研究在對VSV-IND和VSV-NJ的G蛋白抗原性進行分析的基礎上，選取抗原表位較密集且交叉性較多的區(qū)域，利用大腸桿菌體外分別表達兩個血清型的G-657 bp和G-666 bp基因片段，將表達純化的蛋白等量混合后建立間接ELISA方法檢測水泡性口炎病毒抗體。

1 材料與方法

1.1 試劑 TRIZol，購自Invitrogen公司；DNA片段回收試劑盒，限制性內切酶Bam HI，Hind III，購自TaKaRa公司；M-MLV反轉錄酶，Taq DNA聚合酶，購自Promega公司；HRP標記的Protein G，購自SouthernBiotech公司。

1.2 病毒核酸、質粒、宿主菌及血清 VSV-IND G6R mutant株病毒核酸，本實驗室保存；VSV NJ株病毒核酸，美國NVSL提供；原核表達質粒pET-32a，大腸桿菌（E.coli）TOP10，Rosetta，本實驗室保存；IND型、NJ型水皰性口炎中和抗體陽性血清，美國NVSL提供。

1.3 水皰性口炎病毒IND型和NJ型G蛋白截短后基因擴增、克隆 根據已知序列，用DNAStar分析VSV-IND和VSV-NJ G蛋白，根據其抗原表位分布，選取了長度為657 bp和666 bp的兩段基因片段，分別命名為IND-G-657和NJ-G-666，并在其兩端利用Oligo 6.0設計以下兩對引物，設計的引物名稱、序列見表1。

表1 用于擴增VSVIND-G-657和NJ-G-666的引物名稱和序列

將VSV-IND株和VSV-NJ株核酸分別進行RT-PCR擴增，將擴增的目的片段克隆于pMD-T20載體并轉化至大腸桿菌TOP10中，將鑒定正確的陽性克隆子進行測序，分別命名為pMD-T20-INDG657和pMD-T20-NJ-G666。

1.4 原核表達載體構建與序列分析 分別用限制性內切酶BamHI，Hind III對pMD-T20-IND-G657、pMD-T20-NJ-G666以及pET-32a表達載體37℃雙酶切后與pET-32a表達載體進行連接，轉化至大腸桿菌TOP10。將鑒定為陽性的質粒分別命名為pET-32a-IND-G657和pET-32a-NJ-G666。

1.5 重組蛋白的誘導表達 將重組質粒pET-32a-IND-G657和pET-32a-NJ-G666分別轉化Rosetta宿主菌，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，在27℃進行誘導表達，將表達產物進行SDS-PAGE電泳。

1.6 重組蛋白的誘導表達優(yōu)化 對加入IPTG的終濃度、培養(yǎng)溫度及誘導時間等條件進行優(yōu)化。

1.7 包涵體蛋白的洗滌與溶解 將包涵體用含2 mol/L尿素的Tris緩沖液進行洗滌，重復兩次后將沉淀用含8 mol/L尿素的Tris緩沖液溶解，進行SDS-PAGE檢測。

1.8 包涵體蛋白的純化、復性 使用HIS.BIND resin蛋白純化試劑盒在變性條件下進行蛋白純化。

1.9 重組蛋白的反應原性檢測 將純化蛋白經SDS-PAGE電泳后，進行電轉印。轉印結束，分別用VSV-IND、VSV-NJ中和抗體陽性血清以及HRP標記的蛋白G進行Western-blot檢測。

1.10 重組間接ELISA方法的建立 將純化的VSV-IND和VSV-NJ重組蛋白等量混合后，按照ELISA方法建立的常規(guī)程序，對方法建立過程中的各個條件進行了優(yōu)化和確定。

1.11 間接ELISA方法特異性試驗 以最適濃度等量混合的抗原包被酶標板，分別對VSV-IND陽性血清、VSV-NJ陽性血清、東部馬腦脊髓炎陽性血清、西部馬腦脊髓炎陽性血清、委內瑞拉馬腦脊髓炎陽性血清以及馬西尼羅病毒陽性血清作1∶100稀釋，作ELISA測定，驗證該方法的特異性。

1.12 板內和板間重復性試驗 用重組蛋白包被ELISA板，對2份陽性血清和2份陰性血清樣品進行檢測，重復4孔，進行板內重復性試驗；用重組蛋白分別包被4塊反應板，分別對2份陽性血清和2份陰性血清進行板間重復性試驗。

1.13 對已知中和效價抗血清的檢測 對中和效價均為1∶64的VSV-IND和VSV-NJ陽性血清從1∶4開始作2倍系列稀釋至1∶64，用建立的方法作ELISA檢測，用OD值對稀釋度對數進行線性回歸。

1.14 對臨床樣品的檢測 用建立的間接ELISA方法檢測了VSV陰性馬血清樣品184份和已知中和抗體效價的VSV-IND和VSV-NJ陽性血清各2份。

2 結果

2.1 VSV病毒兩血清型截短的G蛋白基因片段擴增結果 IND型和NJ型水泡性口炎病毒截斷的G蛋白基因擴增結果，電泳結果顯示，PT-PCR擴增產物大小與預期結果一致，分別為657 bp和666 bp（見圖1）。

2.2 IND型水皰性口炎病毒G657、NJ型水皰性口炎病毒G666原核表達載體的構建與序列測定分析 將RT-PCR產物克隆至pMD-T20載體后，通過BamHI、Hind III雙酶切和T4連接酶的連接，成功將目的片段分別構建到表達載體pET-32a上，測序結果表明，插入的IND-G-657和NJ-G-666基因的重組質粒序列與GenBank中基因序列一致，方向和位置與預期結果一致。

2.3 IND型和NJ型水皰性口炎病毒截斷的G蛋白的誘導表達 將重組質粒pET-32a-IND-G657和pET-32a-NJ-G666轉化Rosetta宿主菌后。經摸索，確定在37℃培養(yǎng)至OD600達0.6左右，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，27℃繼續(xù)培養(yǎng)5 h，此條件下表達量較大。結果見圖2和圖3，誘導后5 h，可觀察到分子量約為30 kDa的重組蛋白。

2.4 重組蛋白的表達條件優(yōu)化 經研究確定的最佳表達條件為在菌液OD600nm=0.6時，用1 mmol/LIPTG在27℃誘導5 h，可產生部分可溶性表達，但大部分目的蛋白為包涵體表達，但極易溶于2 mol/L尿素中。

2.5 重組蛋白的反應原性檢測 進行Westernblot檢測，可以檢測到約30 kDa大小的預期條帶，結果見圖4。表明重組蛋白具有良好的反應原性。2.6 重組ELISA方法的建立 經對ELISA建立過程中的各個條件進行優(yōu)化結果如下：抗原最佳包被濃度為0.24 μg，血清最佳稀釋度為1∶100時；最佳包被條件為37℃作用2 h，然后4℃過夜；最佳封閉液為含1%卵清蛋白的PBST。

經對30份VSV陰性血清進行測定，確定樣本臨界值為0.3。

2.7 特異性交叉反應試驗 結果表明，除VSV IND型和NJ型陽性血清結果為陽性外，其他病毒血清和陰性對照血清的OD450nm值均小于0.3，為陰性。

2.8 重復性試驗 對于4份血清樣品，板內重復試驗變異系數最大為3.24%，小于5%；板間重復試驗的變異系數最大為9.84%，小于10%。

2.9 對已知中和效價抗血清的檢測 線性回歸結果見圖5和圖6。已知中和抗體效價的血清稀釋度的對數與OD450的平均值的對數呈線性相關，R2分別為0.996和0.998，進一步說明建立的方法可用于VSV中和抗體的檢測。

2.10 對臨床樣品的檢測 用建立的間接ELISA方法和中和試驗方法檢測了VSV陰性馬血清樣品184份和已知中和抗體效價的VSV-IND陽性血清和VSV-NJ陽性血清各2份，其檢測結果一致。

3 結論與討論

在本研究中,用分子生物學軟件分析水皰性口炎病毒印第安那型（IND型）和新澤西型（NJ型）G蛋白抗原表位分布，在抗原表位較密集的區(qū)域設計引物，采用RT-PCR方法分別擴增水皰性口炎病毒IND型657 bp G蛋白基因片段和NJ型666 bp G蛋白基因片段，并將其克隆到pET-32a表達載體。對表達蛋白進行純化及Western-blot檢測驗證正確后，將2個血清型的重組G蛋白等量混合作為檢測抗原包被酶標板，建立了可檢測IND型和新澤西NJ型水皰性口炎病毒抗體的間接ELISA方法。

ELISA方法具有特異、敏感、重復性好以及易于操作等優(yōu)點，已經廣泛用于多種動物傳染病的檢測。本研究利用原核表達的重組蛋白建立了同時檢測水皰性口炎病毒IND型和NJ型兩種血清型抗體的間接ELISA方法，并通過試驗表明，重組蛋白與VSV IND型和NJ型兩種血清特異性反應均良好，可以用于水皰性口炎病毒的IND型和NJ型的檢測。進一步收集更多數量的血清對我們的方法進行驗證和完善，將是我們今后的重要任務。

[1]殷震，劉景華.動物病毒學[M].北京:科學出版社，1997.

[2]周學章，高豐，趙文斌.動物水泡性口炎病毒的抗原性[J].黑龍江八一農墾大學學報，2003，15(2):68-72

[3]Schmidtmanm E T，Tabachnick W J.Epizootic of vesicular stomatitis in the western united states[J].J Med Entoma，1999，36(1):71 991-71 995.