復方中藥合劑對雞紅細胞免疫功能的影響

靳雙星，張桂枝

（河南牧業經濟學院畜牧工程系，河南 鄭州 450011）

動物的紅細胞與白細胞一樣，具有重要的免疫功能，其基礎是紅細胞表面具有C3b受體（C3bR）。紅細胞可通過其表面的C3bR，發揮清除免疫復合物（IC）、促進吞噬、提呈抗原及激活補體等多種作用[1]。研究表明，許多中草藥可增強紅細胞免疫吸附能力，減少異物對機體的危害[2-8]。前期研究表明，自擬的復方中藥合劑能促進免疫器官的發育，增強疫苗的免疫效果，提高熱應激下肉仔雞的生長性能，增強機體清除自由基的能力，提高機體抗氧化水平。本試驗旨在探討飲水中添加復方中藥合劑，對肉仔雞紅細胞免疫功能的影響，為該制劑的臨床推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品 復方中藥合劑由連翹、黃芪、板藍根、茯苓、白術、枳實、山楂、甘草8味中藥組成。連翹采用醇提法提取連翹提取物；白術、枳實采用蒸餾法提取揮發油，濾液與黃芪、茯苓、甘草、山楂、板藍根混合水煎2次，合并上述濾液濃縮至比重1.10（溫度60℃）、加入乙醇使其沉淀，濾過；濾液與連翹提取物混合，加入白術、枳實揮發油及吐溫-80，加入30%蔗糖，調節藥物濃度至1∶1，并調節pH值至中性，滅菌備用。

1.2 材料與試劑 離心機、恒溫水浴箱、顯微鏡、計數器、小離心管、血細胞計數管。酵母試劑、Hank′s液、家兔血清、瑞氏-姬姆薩染液等。

1.3 試驗動物與設計 1日齡健康AA肉仔雞，隔離飼養至7日齡，選取120只體重相近健康的肉仔雞（雌雄各半），隨機分為3組，每組4個重復，每個重復10只雞，分籠飼養。A組作為空白對照組，不進行新城疫活疫苗免疫；B、C兩組均在7日齡2倍量點眼滴鼻接種新城疫活疫苗LaSota株，B組正常飲水，C組接種疫苗的同時在飲水中添加1.0%復方中藥合劑，連續用藥7 d。在14、21、28日齡和35日齡時，每個重復隨機抽取2只雞，每組8只雞，心臟采集血液，1%肝素抗凝，待檢。

1.4 紅細胞C3b受體（RBC-C3bR）花環率檢測

1.4.1 C3b致敏酵母懸液制備 將酵母試劑用Hank′s液（pH值7.2）洗1次（1 000 r/min離心10 min），配成含酵母細胞1.0×108/mL的懸液，加等量新鮮家兔血清，混勻，37℃水浴20 min。然后再以Hank′s液洗2次，恢復原濃度，即為C3b致敏酵母細胞懸液。

1.4.2 紅細胞懸液制備 分別將上述各時間采集的肝素抗凝血2 000 r/min離心10 min，吸出上清液 (血漿 )，用Hank′s液洗3次（每次以2 000 r/min離心5 min），最后將紅細胞用Hank′s液稀釋成1.25×107細胞/mL的懸液。

1.4.3 檢測方法 取C3b致敏酵母懸液和紅細胞懸液各50 μL，混勻，于37℃水浴40 min后取出，輕輕搖起，加0.25%戊二醛溶液20 μL固定5 min，用適量Hank′s液稀釋，涂片，干燥，甲醇固定，用瑞氏-姬姆薩染液染色，高倍鏡檢查。以1個紅細胞粘附2個或2個以上酵母細胞為1個花環，計數200個紅細胞，計算出花環率：RBC-C3bR花環率=RBC-C3bR花環數/200×100%。

1.5 紅細胞免疫復合物(RBC-IC)花環率檢測 除酵母細胞不致敏外，其余同RBC-C3bR花環率檢測。

1.6 統計分析 試驗數據采用SPSS 12.0中One-Way ANOVA過程進行單因素方差分析，并進行Duncan′s多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 復方中藥合劑對肉仔雞RBC-C3bR花環率的影響 由表1結果可知 ，A、B、C組之間，RBC-C3bR花環率的形成明顯不同。免疫后第7天（即14日齡），C組高于空白對照A組，但無顯著性差異（P＞0.05）；B組顯著低于A組（P＜0.05）；C組極顯著高于B組（P＜0.01）。免疫后第14天（即21日齡），B組高于A組，但無顯著性差異（P＞0.05）；C組極顯著高于A、B組（P＜0.01）。免疫后第21天（即28日齡），B組顯著高于A組（P＜0.05），C組極顯著高于A、B組（P＜0.01）。免疫后第28天（即35日齡），C組極顯著高于A組（P＜0.01），顯著高于B組（P＜0.05）。

表1 復方中藥合劑對肉仔雞RBC-C3bR花環率的影響

2.2 復方中藥合劑對肉仔雞RBC-IC花環率的影響 由表2結果可知 ，A、B、C組之間，RBC-IC花環率的形成明顯不同。免疫后第7天（即14日齡），C組顯著高于A組（P＜0.05），極顯著高于B組（P＜0.01）；B組顯著低于A組（P＜0.05）。免疫后第14天（即21日齡），C組極顯著高于A、B組（P＜0.01），A組與B組之間無顯著性差異（P＞0.05）。免疫后第21天（即28日齡），C組極顯著高于 A、B組（P＜0.01），B組顯著高于 A組（P＜0.05）。免疫后第28天（即35日齡），C組極顯著高于A組（P＜0.01），顯著高于B組（P＜0.05）。

3 討論

表2 復方中藥合劑對肉仔雞RBC-IC花環率的影響

紅細胞膜上已明確的補體受體有I型補體受體（CR1）和Ⅲ型補體受體（CR3）。CR1由 Fearon于1979年首次分離，是紅細胞免疫的重要基礎。目前認為，絕大多數C3b免疫復合物(C3b-IC)可與CR1連接。CR1廣泛存在于紅細胞、多形核白細胞、巨噬細胞以及T、B淋巴細胞膜的表面。不同細胞所含CR1數量不同[9]，其中紅細胞為950個，B細胞為2 100個，多形核白細胞為57 000個，單核細胞為48 000個。盡管單個白細胞表面CR1較紅細胞多，但由于血液中紅細胞總數遠遠超過白細胞總數，并且循環系統中約95%的C3b受體位于紅細胞膜上，所以紅細胞與循環免疫復合物結合的機率是白細胞的500～l 000倍。因此，體內對免疫復合物的清除起主要作用的是紅細胞而不是白細胞[1，9-10]。

紅細胞粘附的免疫復合物隨血流被帶到固定吞噬系統(如肝、脾)。固定吞噬系統捕獲紅細胞結合的免疫復合物后，通過巨噬細胞膜表面的Fc受體與免疫復合物中Fc段結合。此時，紅細胞從免疫復合物上解離，再度進入循環，而捕獲了免疫復合物的巨噬細胞則通過膜表面的CR1受體再與免疫復合物的補體C3b結合，Fc受體與CR1受體的協同作用使巨噬細胞的吞噬作用加強，將免疫復合物吞噬，并清除出體內。

紅細胞的粘附活性可作為評價紅細胞免疫功能的重要指標。郭峰等建立了簡易的紅細胞C3b受體酵母花環試驗與紅細胞免疫復合物酵母花環試驗，用于測定RBC-C3bR花環率和RBC-IC花環率。RBC-C3bR花環率和RBC-IC花環率高低可作為紅細胞免疫粘附功能的指標。

本試驗研究結果表明，健康雞經新城疫活疫苗免疫后，RBC-C3bR花環率和RBC-IC花環率與空白對照組相比短暫顯著降低，說明用新城疫活疫苗免疫會引起機體紅細胞免疫功能短暫性下降，與喬海博等試驗結果一致[11]，這可能是新城疫活疫苗毒株進入機體后破壞血液中紅細胞膜上的C3b受體所致。紅細胞C3b受體分子是分子量約為200 000的糖蛋白，極易受到各種抗原的危害。飲水中添加復方中藥合劑，在不同日齡均能不同程度提高RBC-C3bR花環率和RBC-IC花環率，與疫苗對照組相比存在顯著或極顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。說明復方中藥合劑能顯著提高紅細胞的免疫功能，并能克服因接種疫苗引起紅細胞免疫功能短暫下降的不良反應。

[1]薛擁志，王愛華，利凱，等.紅細胞免疫研究進展[J].安徽農業科學，2007，35(12):3 558-3 560.

[2]馬德惠，楊漢春.中藥疫苗對細胞免疫功能和淋巴細胞轉化作用的影響[J].中國獸醫雜志，2008，44(11):48-50.

[3]夏春麗，殷中瓊，劉宇，等.當歸補血湯對肉雞免疫臟器指數和紅細胞免疫功能的影響[J].安徽農業科學，2011，39(18):11100-11102.

[4]賈仁勇，周墨梅，葛宇，等.川牛膝多糖對雞紅細胞免疫及外周血淋巴細胞免疫功能的影響[J].中國獸醫雜志，2009，45(1):35-38.

[5]陳書明，梁新峰，雷娜，等.復方中藥對感染NIB雞紅細胞免疫功能的影響[J].中國獸藥雜志，2009，43(12):6-9.

[6]明海霞，陳彥文，王強，等.甘肅金銀花對小鼠紅細胞免疫功能影響的實驗研究[J].西部中醫藥，2012，25（12）:16-17.

[7]史紅專，王恬，王亞君.香芪四君子湯對小鼠紅細胞免疫功能和抗熱應激的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2005，11（6）:33-35.

[8]楊宏斌，溫潔，溫偉業.新復方中藥制劑“沙大凈”對雞紅細胞免疫功能的影響[J].山西農業大學學報，2006，1:70-73.

[9]白東英，王超群，馬彥博，等.畜禽紅細胞免疫功能的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫，2006，12:21-23.

[10]李曉卉，殷中瓊.青刺果黃酮對雞紅細胞免疫及外周血淋巴細胞免疫功能的影響[J].中國獸醫雜志，2009，45(3):43-45.

[11]喬海博，朱曉慶，谷新利.復方中藥多糖對雞紅細胞免疫功能的影響[J].江蘇農業科學，2013，41（1）:206-208.