中藥復方對熱應激肉兔腸道組織結構及肝臟抗氧化機能的影響

王自力，張 翥，唐 琪，涂君平，王明周，王陳超，賀庭禎

（西南大學動物科技學院，重慶 北碚 400715）

熱應激是指在高熱環境下機體對熱環境對機體提出的任何要求所作出的非特異性的生理反應的總和。重慶地區夏季氣溫常在30℃以上，甚至可達45℃，而肉兔生長最適溫度為15℃～25℃，當環境溫度超過30℃時，可引起應激反應，導致機體免疫力下降，甚則發生疾病死亡。本文通過研究高溫應激對肉兔的腸道組織結構及肝臟抗氧化機能的影響，并對中藥復方的調控作用進行研究，為研制肉兔抗熱應激中藥提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 選擇35日齡，體重在650～750 g之間的健康新西蘭肉兔24只（購自重慶市合川區淶灘鎮鄧銀養兔場）。隨機分為對照組、熱應激、中藥組，每組8只，雌雄各半。預飼期為7 d，試驗期為21 d。

1.2 藥品與儀器

1.2.1 中藥復方制備藿香、蒼術、石膏、黃柏、連翹、黃連、梔子等藥物按一定比例混合，中藥均購自重慶市北碚區桐君閣大藥房。將各中藥置于35℃烘箱內干燥4 h，粉碎后經100目鋼篩過篩后，按5%比例加入肉兔配合飼料（成都市新津金陽飼料有限公司，批號：20100802）中，于西南大學飼料與營養實驗室重制粒。

1.2.2 試劑及藥品 谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（批號：20100720）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（批號：20100720）、總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒（批號：20100720）、超氧化物歧化酶（SOD）（批號：20100720）檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；乙醇、蘇木精、二甲苯等。

1.2.3 儀器設備 UV 570型紫外分光光度計，Sigma低溫高速離心機，LEICA RM-2016型切片機、中藥粉碎機，KYW32型飼料制粒機、WD-02A型干燥箱等。

1.3 動物處理方法 在重慶高溫8月時，將對照組肉兔飼喂于25℃～28℃，65%濕度環境中，熱應激組及中藥組肉兔飼喂于高溫環境中（30℃～37℃，65%濕度）。對照組和熱應激組給予常規飼料，中藥組給予含5%中藥復方的飼料，采用分欄飼喂，自由采食和飲水，試驗期為21 d。

1.4 樣品采集與指標測定 于第22天處死各組肉兔，分別采集十二指腸、空腸、回腸于4%中性甲醛中固定，同時采集肝臟于凍存管中，-80℃保存備用。制作肉兔十二指腸、空腸、回腸的組織切片，H.E.染色，觀察腸道組織結構變化；按照試劑盒說明書，制作肝臟組織勻漿，3 000 r/min離心10 min后取上清測定總蛋白含量后，分別測定總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力。

1.5 數據統計與分析 采用SPSS 11統計軟件進行單因素方差（one-way ANOVA）分析，結果以-X±SD表示。

2 結果

2.1 環境溫度變化 由圖1可知，環境熱應激溫度均高于30℃，對照組環境溫度均未高于28℃，肉兔在環境溫度高于30℃時，均發生熱應激。

2.2 肉兔腸道組織結構變化 對照組：十二指腸、空腸和回腸黏膜結構完整，層次分明，腸黏膜上皮細胞的輪廓清晰，染色鮮明，排列規則，腸道各層組織均完整（圖2-A、圖3-A、圖4-A）。

熱應激組：十二指腸、空腸黏膜上皮脫落固有層裸露，黏膜下水腫，腸腺萎縮，頂端絨毛脫落，腸道微血管內充血腫脹（圖2-B、圖3-B）；回腸各組織結構基本完整（圖4-B）。

中藥組：十二指腸、空腸和回腸黏膜結構基本完整，層次分明，腸黏膜上皮細胞的輪廓清晰，排列較整齊，腸絨毛結構完整（圖2-C、圖3-C、圖4-C）。

2.3 肉兔肝臟組織抗氧化指標含量變化 由圖5可知，熱應激組肉兔肝臟組織T-AOC顯著低于對照組和中藥組（P＜0.05），而對照組和中藥組無顯著差異（P＞0.05）；由圖6可知，熱應激組肉兔肝臟總SOD活性顯著低于對照組和中藥組（P＜0.05），而中藥組和對照組無顯著差異（P＞0.05）。

由圖7可知，熱應激組肉兔肝臟MDA含量顯著高于對照組和中藥組（P＜0.05），而中藥組與對照組無顯著差異（P＞0.05）；由圖8可知，熱應激組肉兔肝臟GSH-PX活性高于對照組和中藥組，但各組肉兔肝臟GSH-PX活性無顯著差異（P＞0.05）。

3 分析與討論

肉兔是恒溫動物，最適生長溫度為15℃～25℃，最適濕度為60%～65%。當肉兔處于高溫高濕環境中時可發生應激反應，引起代謝率降低[1-2]，出現增重速度下降，生長緩慢，肉質變差，種兔配種受胎率下降等；刺激促腎上腺素的合成與分泌，使糖皮質激素增加而降低體液免疫和細胞免疫功能，導致免疫器官萎縮和抗體合成減少等，從而誘發多種疾病給肉兔養殖造成巨大經濟損失[3]。

3.1 腸道組織結構變化 小腸的絨毛完整性及結構的完整性是衡量小腸消化吸收功能的重要指標，與動物生長速度呈正相關關系[4]。本研究表明，肉兔在高溫熱應激后，腸黏膜結構損傷嚴重，尤其是十二指腸和空腸受損最為嚴重（圖2-B和圖3-B），導致肉兔腸道吸收能力減弱。現有研究表明，熱應激后肉兔腸黏膜結構嚴重損傷，各腸段的絨毛長度、寬度、隱窩深度，絨毛長度/隱窩深度均出現不同程度的降低[4]，進一步印證了肉兔的熱應激反應可導致腸道組織結構受損。同時，在高溫環境中給予中藥后，肉兔腸絨毛、腸腺結構基本保持完整，腸黏膜損傷程度較低（圖2-C、圖3-C、圖4-C），說明中藥復方可明顯減輕高溫應激對肉兔腸道組織的損傷。

由于重慶地區夏季常為高溫高濕天氣，為濕熱之邪，易郁阻中焦脾胃，引起脾胃運化功能受阻，治宜清熱祛濕。本試驗中藥復方由藿香、黃柏、蒼術、石膏、連翹、黃連、梔子等七味藥組成，具有清熱解暑、利濕健脾功效。研究表明，以藿香、黃柏、蒼術、石膏為組成的中藥復方可有效減輕熱應激對豬腸道結構和黏膜免疫機能的損害[5-6]。因此，本中藥復方具有維護熱應激肉兔腸道組織結構的完整性的功效，可有效清解肉兔在高溫高熱環境下感受的濕熱之邪，維護中焦脾胃功能正常，有利于肉兔的正常生長。

3.2 肝臟抗氧化指標變化 在動物有機體處在正常的生理狀態下，自由基的產生與清除處于動態平衡狀態。當發生衰老和應激時，機體代謝發生紊亂，產生大量的自由基，機體若不能及時清除多余自由基，可造成自由基大量蓄積，可導致組織細胞膜完整性受到損害，引起機體免疫力和抵抗力下降。

3.2.1 總抗氧化能力（T-AOC）的變化 T-AOC代表機體防御體系的抗氧化能力，是衡量機體抗氧化系統功能狀況的綜合性指標[7]。本研究表明，在高溫條件下，熱應激組肉兔肝臟組織總抗氧化能力出現了顯著下降，說明肉兔的抗氧化酶系統和非酶系統對外來刺激的代償能力出現顯著下降，且機體自由基代謝加快，體內自由基增多，導致肝臟組織總抗氧化能力下降；中藥復方可有效維護肉兔機體的代償能力和抗氧化能力于正常水平，即中藥復方具有增強肉兔肝臟組織抗氧化能力的功效。研究表明，黃連、連翹、梔子、藿香、黃柏均具有抗氧化功效，可有效清除自由基對機體組織細胞的損害作用，維持機體組織抗氧化能力[6，8-11]。

3.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）變化SOD是機體中的一種重金屬酶，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，可清除超氧陰離子自由基，發揮抗炎作用，反映機體清除氧自由基能力；MDA是脂質過氧化中產生的脂質過氧化產物，可引起黏膜損傷和激活補體系統，使巨噬細胞釋放大量炎癥介質[12]，反映細胞脂質過氧化程度。本研究表明，熱應激組肉兔肝臟組織中SOD活性顯著下降，MDA含量則顯著上升，說明熱應激加速了肉兔機體組織的脂質過氧化作用，并導致其抗氧化能力下降，可引起機體自由基增多，破壞體內的抗氧化酶系統，導致組織損傷和疾病的發生。中藥復方可有效降低熱應激肉兔的脂質過氧化作用，增強機體抗氧化能力，即中藥復方可保持肉兔機體內氧自由基的產生和清除處于平衡狀態，作為機體“正氣”之一的SOD水平仍然保持在正常水平。研究表明，連翹具有恢復小鼠血清SOD、乳酸脫氫酶（LDH）和MDA含量正常的功效[13]。

3.2.3 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的變化GSH-PX是機體內重要的過氧化物酶，具有清除體內H2O2和脂類氫過氧化物，阻斷脂質過氧化連鎖反應，具有保護細胞結構和功能完整的作用。研究表明，熱應激可引起活性氧的釋放、氧自由基的堆積，過氧化物產生越多，GSH-PX活性下降越明顯[7]。在本研究中，熱應激組肉兔肝臟GSH-PX活性雖高于對照組和中藥組，但無顯著差異（P＞0.05），說明夏季高溫應激中，肉兔可能通過其他途徑如增強SOD活性來清除自由基等因素有關，其具體原因需進一步研究。

綜上所述，熱應激可引起肉兔腸道組織結構損傷，尤以十二指腸和空腸最為明顯，肝臟組織中T-AOC、SOD含量下降，MDA含量上升，導致肉兔肝臟組織抗氧化能力下降；中藥復方可有效減輕熱應激對肉兔腸道組織結構的損傷，并可維持熱應激肉兔肝臟組織抗氧化能力于正常水平，其作用機制需進一步研究。

[1]楊奉珠，郭志強，謝曉紅，等.營養調控兔熱應激的研究進展[J].中國草食動物，2011，31(4):68-71.

[2]朱長彬.家兔熱應激及其緩解措施[J].山東畜牧獸醫，2010:48-49.

[3]雷岷，謝曉紅，易軍，等.熱應激條件下日糧消化能水平對肉兔生產性能和養分消化率的影響[J].中國飼料，2012（7）:20-22.

[4]胡艷欣，肖沖，佘銳萍，等.熱應激對豬腸道結構及功能的影響[J].科學技術與工程，2009，9(3):581-586.

[5]王自力.中藥對熱應激豬和小鼠腸道黏膜免疫機能的影響及其組方機制[D].北京:中國農業大學，2007:34～38.

[6]王偉，徐淑芳，郭凱軍，等.藿香揮發油黃柏生物堿對高溫刺激下IEC-6細胞分泌SOD GSH-Px和MDA的影響[J].中國獸醫雜志，2010，46（7）:60-64.

[7]王妍琪.茶多酚，維生素E對肉仔雞熱應激時生產性能和抗氧化性能的影響[D].哈爾濱:東北農業大學，2004.

[8]樸香蘭，吳倩，田燕澤.連翹的抗氧化成分研究[J].時珍國醫國藥，2010，21(6):1307-1307.

[9]袁王俊，李彩芳，丁秋瑾,等.黃連抗氧化活性研究[J].廣西植物，2009，29(5):694-697.

[10]陳陽，張浩，王文君,等.桅子黃多酚含量與抗氧化活性的相關性研究[J].食品工業科技，2011，32(10):125.

[11]薛曉倩，黃學寬，高寧，等.藿香正氣液對濕阻證大鼠抗氧化作用及對胃黏膜EGFR表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(021):230-234.

[12]王艷萍，祁克宗，涂健，等.內毒素對仔雞血漿SOD活性及MDA水平的影響[J].動物醫學進展，2006，27(5):63-65.

[13]侯改霞，楊建雄.連翹葉提取物對力竭及恢復小鼠血清SOD，LDH活性和MDA含量的影響[J].河南大學學報:自然科學版，2009，39(005):509-511.