新疆庫車豬場豬圓環(huán)病毒2型感染調(diào)查

劉居萍，喬 軍，葛陽春

（1.新疆石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003；2.新疆庫車縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆 庫車 842000）

豬圓環(huán)病毒病(PCVD)是由豬圓環(huán)病毒(PCV)引起的一種多系統(tǒng)功能障礙性疾病，導致機體免疫抑制。圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員，是所有已知動物病毒中最小的病毒粒子，為單股環(huán)狀DNA病毒。基因組由一個單股環(huán)狀組成，基因組全長一般為1 766～1 768 nt。PCV-2根據(jù)基因組遺傳距離的大小可以劃分為3個基因型，分別為PCV-2a、PCV-2b和PCV-2c，其中PCV-2c基因型僅在丹麥有發(fā)現(xiàn)[1]。臨床上主要病癥以新生仔豬先天性腦震顫和斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)最為常見，主要表現(xiàn)為進行性呼吸困難，消瘦，體表淋巴結腫大，腹瀉，黃疸，貧血，甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。豬圓環(huán)病毒分為2個血清型，PCV-1和PCV-2。其中PCV-1不引起臨床癥狀，廣泛存在于正常豬體各器官組織及豬源細胞。PCV-2對各種年齡的家豬和野豬均有致病性，目前認為PCV-2在世界各地到處都存在，無論是否發(fā)生PCVD，是近年來獸醫(yī)界引人注目的一種新的豬傳染病。自從1991年加拿大首次報道了PCV-2是PMWS的主要病原以來[2]，其在世界各地迅速蔓延。我國也于2000年檢測到了該病毒的存在[3]，該病毒在我國豬群的感染率近乎50%，給我國的養(yǎng)豬業(yè)也造成了嚴重的損失。

PMWS既可水平傳播，導致斷奶仔豬發(fā)病死亡，亦可垂直傳播，引起繁殖障礙。PCV-2主要侵害免疫系統(tǒng)，導致感染豬免疫抑制，降低機體對其他病原體的抵抗力和疫苗的反應性，可導致多種疾病的發(fā)生，容易導致其他病毒和細菌的繼發(fā)感染，使死亡率明顯升高。近年來，隨著庫車縣養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，一些養(yǎng)豬場從外地引入種豬。伴隨在引種的同時，一些新的豬病也帶入本縣。近兩年，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)豬場每年疑似豬圓環(huán)病毒病的病例不斷增加，為了了解庫車縣豬圓環(huán)病毒病流行情況，筆者于2012年8月至2012年12月在全縣6個區(qū)域的32個豬場隨機抽取443份血清樣品，應用ELISA方法檢測了PCV-2抗體陽性率。通過對不同豬場不同生產(chǎn)階段豬群PCV-2血清流行病學研究，分析PCV-2在我縣不同豬場和不同生產(chǎn)階段豬PCV-2的感染狀況。為進一步證實該病在我縣的存在，對可疑死亡生豬的病料組織進行了豬2型圓環(huán)病毒全基因組的克隆、測序分析，不但為該病積累了流行病學資料，而且也為我縣對該病的科學防控提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血清樣品和病料組織 選擇庫車縣部分有代表性的養(yǎng)豬場32個，隨機采樣。按相關的生物安全要求進行無菌采血，分離血清備用，并對豬的日齡、防疫情況以及臨床健康狀況作詳細記錄。共采集443份血清。將庫車縣豬場疑似PCV-2感染的發(fā)病豬采集的淋巴結、脾臟、肺臟及肝臟等組織，共采集18頭病豬病料，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 豬圓環(huán)病毒病酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)診斷試劑盒(北京世紀元亨動物防疫技術有限公司)，試劑生產(chǎn)批號：PCV20120618E。Taq plus DNA聚合酶、dNTPs、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒，購自北京諾維森生物科技有限公司。pMD18-T載體，購自大連TaKaRa公司。病毒基因組提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司、Marker2000，購自廣州東盛生物科技有限公司。

1.3 PCV-2引物的設計 根據(jù)DNAMAN生物軟件針對PCV-2基因設計PCR引物，擴增長度為982 bp，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列 PCV-N1：5'-ACCAGCGCACTTCGGCAGCG-3'；PCV-N2：5'-TCATATGGAAATTCAGGGCA-3'。PCVN3：5'-TTACCAGCAATCAGACCCCG-3'；PCV-N4：5'AATACTTACAGCGCACTTCT 3'。

1.4 ELISA檢測血清PCV-2抗體 依照豬圓環(huán)病毒病酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)診斷試劑盒操作說明步驟進行，洗滌液20倍稀釋配制、樣品1∶5的體積稀釋、加樣、封膜、孵育、洗版、加底物、加終止液。按照被檢樣品OD450值＜臨界值，為PCV-2抗體陰性；被檢樣品OD450值≥臨界值，為PCV-2抗體陽性的標準判定結果。

1.5 病料DNA提取 用天根生化科技(北京)有限公司提供的DVA病毒基因組提取試劑盒方法提取病料中的DNA，試劑盒里有緩沖液GB、漂洗液RW、蛋白酶K、吸附柱、收集管、ddH2O等。將病豬的病料5 g左右用1～1.5 mL生理鹽水研磨，研磨約5 min，研磨后液體放入1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心5 min，取上清液。按照組織/細胞DNA抽提試劑盒的操作說明提取總DNA。

1.6 樣品中PCV-2的檢測 通過對PCR擴增條件和反應程序的優(yōu)化，確定方案如下：取提取的DNA為模板4 μL，引物PCV-N1（25 pmol/μL）、PCV-N2（25 pmol/μL）各 1μL，PCR Mix 10 μL，水 6 μL，混勻。PCR采用20 μL的反應體系，反應條件為：95℃預變性4 min；95℃變性50s，51℃退火40s，72℃延伸1 min 20s，36個循環(huán)；72℃延伸l0 min；4℃無限延伸。PCR反應進行36個循環(huán)，擴增反應完成后，PCR擴增產(chǎn)物在l%瓊脂糖凝膠中，以0.5×TAE緩沖液，120 V電壓電泳30 min，溴化乙錠染色。電泳結束后，在紫外線下觀察，記錄結果并拍照保存。

1.7 陽性樣品PCV-2全序列的擴增與克隆 在鑒定為PCV-2陽性的樣品中，選取條帶較亮樣品的DNA,用引物PCV-N1和PCV-N2進行全序列的擴增，反應體系為20μL，反應條件為：95℃預變性4 min；95℃變性50s，51℃退火40s，72℃延伸1 min 20s，36個循環(huán)；72℃延伸l0 min，4℃無限延伸。將PCR陽性擴增條帶進行膠回收純化，采用北京諾維森生物科技有限公司生產(chǎn)的DNA回收試劑盒回收擴增出來的DNA片段。將回收產(chǎn)物與pMD-19-T載體16℃連接過夜，連接反應體系：回收產(chǎn)物 4.5 μL，pMD-19-T載體 0.5 μL，SolutionⅠ連接酶5 μL，共10 μL。將連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)15 h后，挑取白色菌落接種于10 mL含Amp的液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12 h，然后做菌落PCR鑒定。在含有Amp的LB固體平板上挑取單個白色菌落作為模板進行菌落PCR擴增，反應體系與條件同前。取10 μL反應產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在凝膠成像系統(tǒng)下進行觀察。

1.8 庫車縣PCV-2流行株基因分型 選取經(jīng)鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒的菌落，激活培養(yǎng)后送華大基因生物工程技術服務公司進行測序，然后與國內(nèi)外流行株進行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分析。

2 結果

2.1 血清中PCV-2抗體的ELISA檢測結果 在被檢的443份血清中，共檢出PCV-2抗體陽性的血清367份，平均陽性率為82.84%。從表1可知，不同生長階段豬陽性率不同，斷奶仔豬、育肥豬、母豬、公豬的PCV-2陽性率分別是79.09%、83.5%、90.27%、83.3%。

表1 不同年齡階段豬血清樣品中PCV-2抗體檢測

2.2 不同區(qū)域豬PCV-2血清抗體檢測結果 不同區(qū)域豬場飼養(yǎng)管理、飼養(yǎng)環(huán)境不同，豬群血清PCV-2抗體平均陽性率有較大差異。根據(jù)現(xiàn)場調(diào)查情況及表2可以看出,飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)管理好的區(qū)域豬場陽性率相應較低。

2.3 PCV-2的基因組PCR擴增結果 將采取的18頭生豬組織無菌研磨，從中提取DNA，將其進行PCR擴增，之后取擴增產(chǎn)物20 μL進行電泳檢測，結果在第1、3、5、6、7、9、11、12、17、18孔分別出現(xiàn)了1條 982 bp左右的條帶（圖1、圖2），與預期片段大小一致。

2.4 PCV-2的測序結果分析 將鑒定正確的重組載體送華大基因生物工程技術服務公司進行測序，測序結果經(jīng)過在基因庫里進行比較此次分離鑒定的PCV-2與基因庫上已提交的PCV-2的其他菌株如 GD-sz、DF-1、NY0912、GXXJ1104、CZ1005存在著99%的同源性。

表2 不同區(qū)域豬血清樣品中PCV-2抗體檢測

3 討論

本試驗血清樣品來自本縣多個豬場的不同日齡豬群，具有一定代表性。通過ELISA檢測了32個豬場的443份血清樣品，對不同養(yǎng)殖場、年齡豬的血清學調(diào)查數(shù)據(jù)進行了綜合分析。從6個區(qū)域的血清樣品PCV-2抗體檢測結果顯示，總抗體的陽性率為82.84%，這與其他有關報道的抗體總陽性率基本相符合[4]。ELISA結果顯示，庫車縣PCV-2抗體總平均陽性率較高，應該引起高度重視。

本次調(diào)查顯示，所有受檢豬場均存在不同程度PCV-2感染。對血清來源不同日齡段進行分析，不同日齡段的豬群血清PCV-2抗體平均陽性率有較大差異。母豬抗體陽性率最高為90.27%，其次為公豬和育肥豬，抗體陽性率分別是83.3%、83.5%，仔豬抗體陽性率最低為79.09%，這與先前報道的PCV-2病毒感染隨豬的年齡增長而升高結論是一致的[5]，與國內(nèi)報道的同一豬群豬的年齡越大，PCV-2的抗體陽性率就越高一致[6]。

經(jīng)過對庫車縣生豬的組織病料進行PCV-2的病原學檢測，檢測了18份病料，陽性病料10份，陽性率是55.6%。測序結果可以發(fā)現(xiàn)與其他地方的PCV-2相比，PCV-2的流行和分布具有一定的地域性，在已確定庫車縣的生豬未經(jīng)免疫的時候已經(jīng)存在PCV-2病毒，為我縣以后的預防和控制此病提供了科學的數(shù)據(jù)。分析和確診我縣PCV-2毒株的基因組，對于研究其分子流行病學具有十分重要的意義。

PCV-2感染在我國豬群中已十分普遍，現(xiàn)己證實圓環(huán)病毒會導致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(PMWS)的主要病原豬是圓環(huán)病毒的天然宿主,病毒通過胎盤垂直傳播,或在豬群中水平傳播，各種年齡段、不同性別的豬都可感染，公豬和母豬發(fā)病率高。由于PMWS是一種免疫抑制性疾病，往往會給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的威脅和損失。因此各養(yǎng)殖場應嚴格按生豬計劃免疫程序，提高其他疫病的免疫保護率，減少混合或繼發(fā)感染。重點加強豬瘟、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的免疫，同時加強豬偽狂犬病、豬細小病毒病的免疫工作，提高豬的抵抗力，減少其他疾病與豬圓環(huán)病毒病的協(xié)同作用，從而降低生豬疫病的發(fā)生。

[1]蔡林，胡冬梅，李曉霞，等.豬圓環(huán)病毒2型10JS-2株的分離與全基因組序列分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39(7):6-10.

[2]王忠田，楊漢春.規(guī)模化豬場豬圓環(huán)病毒2型感染的流行病學調(diào)查[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46(5):3-4.

[3]王亞丹，盧權威，陳紅英，等.豬圓環(huán)病毒2型河南株全基因組的克隆與序列分析[J].中國獸醫(yī)學報，2012，32(10):1429-1434.

[4]趙東升，劉有昌，安福生，等.近年來我國豬圓環(huán)病毒病的流行狀況及分析[J].養(yǎng)豬，2009，1:57-59.

[5]盧寄軍，王祝榮，張進.湖南省豬圓環(huán)病毒2型流行病學調(diào)查[J].中國動物檢疫，2012，29（2）：42-43.

[6]高利波，高洪，趙汝,等.豬圓環(huán)病毒2型感染血清學調(diào)查[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（12）:207-208.