金黃色葡萄球菌產腸毒素規律的初步研究

馮翠蘭，劉富來

（佛山科學技術學院，廣東 佛山 528231)

金黃色葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxin，SE）主要是由血漿凝固酶或耐熱核酸酶陽性的菌株所產生的一類結構相關、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白質，為單肽鏈蛋白質[1]。近年來的研究表明，金黃色葡萄球菌腸毒素具有獨特高效的誘導機體抗腫瘤免疫反應的特性，把它作為抗腫瘤生物制劑，應用于抗腫瘤療法中，將會有廣泛的應用前景[2-3]。

食品安全是一個重大的世界性公共衛生問題，由金黃色葡萄球菌及其腸毒素引起的中毒案例越來越多，占細菌性食物中毒第一位，而攜帶SEA-SEE基因的金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占金黃色葡萄球菌食物中毒的95%，SE引起的食物中毒和其他相關疾病給我們的生活帶來很大的威脅，由此造成的經濟損失也相當嚴重[4]。金黃色葡萄球菌食物中毒是因進食含有腸毒素的食物，并非活菌所引起，傳統常規法檢測腸毒素需要經過增菌、分離培養、生化鑒定等一系列繁瑣步驟來完成，比較復雜、不敏感，費時費力，全過程大概需要4～8 d，在基層單位難以做到。而且由于該菌廣泛存在，僅檢出金黃色葡萄球菌，而無腸毒素的檢出，是很難作為食物中毒主要依據來判斷。近年來，國際上已將腸毒素檢測列入食品檢驗法規。因此，建立敏感、快速、特異的食品中的腸毒素檢測方法，是食品檢測的一項重要研究內容，對疾控系統快速檢出結果有重要作用，對于保證食品安全衛生有著十分重大的現實意義[5-6]。

因此，研究金黃色葡萄球菌產腸毒素規律，有利于弄清腸毒素的產生情況和進行量的提取擴增，促進腸毒素快速檢測方法的建立和抗癌產品的研發，對于保障食品安全和臨床醫學抗腫瘤有重要意義。

1 材料與方法

1.1 金黃色葡萄球菌 質控金黃色葡萄球菌（ATCC 25923-3）和腸毒素產毒培養基，青島高科園海博生物技術有限公司提供；產腸毒素金黃色葡萄球菌（SEF101）由佛山科學技術學院食品科學實驗室保存，自病例中分離鑒定[7]。

1.2 儀器和試劑 全自動熒光/化學發光分析儀(SpectraMax M2e)，美 國 Molecular Devices生 產 ；YLN-30電腦控制菌落計數器，北京亞力恩科學器材公司生產；PYX-190Z-C震蕩培養箱，廣東韶關科力實驗儀器有限公司生產；透析袋（截留分子量14 000），上海源聚生物科技有限公司提供；葡萄球菌腸毒素SET檢測試劑盒，上海博舜生物科技有限公司提供。

1.3 金黃色葡萄球菌腸毒素提取和測定 取金黃色葡萄球菌單菌落，接種于腸毒素產毒培養基中，依據金黃色葡萄球菌及其腸毒素檢測方法（GB/T4789.10-2003）中的液體透析培養法[8]，置通過充補氮氣和加脫氧劑的方法控制空氣中含氧量的密閉培養裝置中搖振(100 r/min)培養，定時對透析袋外的培養液用全自動熒光/化學發光分析儀進行SE含量測定（本研究所測腸毒素為A-E混合體），吸取培養液后重新調整裝置中空氣含氧量至設置水平。

1.4 腸毒素較優制備條件的單因素試驗

1.4.1 培養溫度對產量的影響 調整培養裝置中空氣含氧量為14.5%，分別于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃培養40 h，測定培養液中SE的含量。

1.4.2 含氧量對產量的影響 設定培養溫度為35℃，依據動態測量含氧量小于±0.5%進行控制，使整個實驗過程的平均含氧量接近所設定12.5%、13.5%、14.5%、15.5%、16.5%環境中培養40 h，測定培養液中SE的含量。

1.4.3 產毒培養時間對產量的影響 設定培養溫度為35℃，空氣含氧量為14.5%的環境中分別培養20、30、40、50、60 h，測定培養液中SE的含量。

1.5 腸毒素制備條件的正交試驗 將培養溫度、培養環境空氣含氧量和產毒培養時間作為因素，按照單因素試驗結果，選取產量最多的水平進行組合，3個因素的3個水平（表1）共同作用，觀察SE產生情況。

表1 正交試驗因素與水平

1.6 金黃色葡萄球菌產SE的特性觀察 質控金黃色葡萄球菌（ATCC 25923-3）和產SE金黃色葡萄球菌（SEF101）分別在最優工藝條件下培養，每隔2 h對透析袋外的培養液用全自動熒光/化學發光分析儀進行SE含量測定，觀察金黃色葡萄球菌產SE的規律。

2 結果和分析

2.1 腸毒素較優制備條件的單因素試驗結果

2.1.1 培養溫度對SE產量影響的結果 培養裝置中空氣含氧量為14.5%培養40 h，于25℃～40℃時培養液中SE的含量呈上升的趨勢，40℃達最大值，40℃～45℃呈下降的趨勢（圖1），溫度對金黃色葡萄球菌產生腸毒素有較大影響，40℃的環境有利于金黃色葡萄球菌產生SE。

2.1.2 含氧量對SE產量影響的結果 于35℃培養40 h，空氣含氧量為13.5%～14.5%時培養液中SE的含量呈上升的趨勢，14.5%～17.5%時呈下降的趨勢（圖2），環境中空氣含氧量對SE產生有明顯影響，含氧量太高或過低均不利于金黃色葡萄球菌產生SE，空氣含氧量為14.5%時有利于金黃色葡萄球菌產生SE。

2.1.3 產毒培養時間對SE產量影響的結果 空氣含氧量為14.5%，培養溫度為35℃，培養時間為0～40 h時培養液中SE的含量呈快速上升的趨勢，40～60 h培養液中SE的含量增長緩慢趨于穩定（圖3），表明培養40 h后金黃色葡萄球菌基本停止產生SE。

2.2 腸毒素制備條件的正交試驗結果 從表2正交試驗結果的極差分析得出3個因素對試驗結果的影響程度為：產毒培養時間＞產毒培養溫度＞環境中氧含量，其中產毒培養時間這個因素對本試驗最為重要，在本次3因素3水平正交試驗設計中，其優方案為A3B2C2，即采用產毒培養時間40 h，培養溫度40℃，環境中氧含量15.5%的條件下，SE產量最大，高達59.31 mg。該試驗結果和其他正交處理間差異顯著，故產毒培養時間40 h，培養溫度40℃，環境中氧含量15.5%為本次正交試驗中的最優條件。

表2 金黃色葡萄球菌產SE的正交試驗

2.3 金黃色葡萄球菌產SE曲線測定 根據國標（GB/T4789.10-2003）規定方法在控制空氣含氧量和設定溫度的條件下，在最優工藝條件下培養質控金黃色葡萄球菌（ATCC 25923-3）和產腸毒素金黃色葡萄球菌（SEF101），通過觀察圖4可知，培養6 h培養液即可檢測到SE存在，之后進入一個緩慢增加的過程直至16 h，接著16～40 h為金黃色葡萄球菌提取液SE含量快速增加過程，40～60 h為穩定期，SE含量增加不明顯（圖4）。質控金黃色葡萄球菌（ATCC 25923-3）和產SE金黃色葡萄球菌（SEF101）SE含量變化情況未見明顯差異。

3 討論

通過單因素試驗和正交試驗得到金黃色葡萄球菌SE產量最大的最優工藝條件。產毒培養40 h，培養溫度為40℃，環境中氧含量15.5%的條件下，SE產量最大，單個菌落SE產量為59.31 mg，3個因素對SE產量的影響程度為：產毒培養時間＞產毒培養溫度＞環境中氧含量，其中產毒培養時間對本試驗最為重要，在合適的環境氧含量條件下選擇適宜的溫度可促進SE的產生。金黃色葡萄球菌產SE曲線表明，培養6～8 h即可檢測到SE的存在，但在40 h后培養液中SE的含量不再明顯增加。因此，作為SE快速檢測，使用全自動熒光/化學發光分析儀最快可在在6～8 h給出確切判斷。

SE作為一種抗腫瘤生物制劑，具有良好的應用前景，獲得大量純度高成分清晰的SE是它的前題，而本研究結果表明，金黃色葡萄球菌在合適的溫度和氧含量條件下，培養40 h即可得到SE最大產量。李獻和馬家斌及林新堅等[9]發現金黃色葡萄球菌臨床分離株在蘑菇罐頭中生長良好，當菌數達到107 CFU/mL時即可檢測出SE，隨后大量積累，培養18 h及以各階段SE檢測結果均為陽性，這與本研究結果基本一致。

[1]羅海波，鮑行豪.細菌毒素研究進展[M].北京：人民衛生出版社，1983.

[2]Shimizu M，Matsuzawa A，Takeda Y.A novel method for modification of tumor cells with bacterial superantigen with a heterobifunctional cross-linking agent in immunotherapy of cancer[J].Mol Biotechno1，2003，25(1):89-94.

[3]胥全彬，張艷紅，張雷雷，等.重組金葡菌腸毒素A的抗癌效應研究[J].中國腫瘤生物治療雜志，2005，12(2):103-106.

[4]陳智，江元山，熊燕，等.金黃色葡萄球菌食物中毒分離株毒素基因的PCR分析[J].中國衛生檢驗雜志，2009，19(1):21-23.

[5]劉飛，李永明，金伯泉.金黃色葡萄球菌腸毒素檢測方法的研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志，2010，26(5):511-513.

[6]任天紅，劉景武，付素蘭.金黃色葡萄球菌腸毒素檢測方法的應用及進展[J].河北醫藥，2008，30(8):1224-1226.

[7]劉富來，馮翠蘭.一株產腸毒素金黃色葡萄球菌致死小鼠的初步研究[J].中國動物檢疫，2010（4）:50-51.

[8]GB/T4789.10-2003.食品衛生微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗國家標準[S].

[9]林新堅，陳濟深，楊佩玉，等.蘑菇罐頭中金黃色葡萄球菌腸毒素研究概況[J].福建農業科技，1994，（5）：23.