15株禽源沙門菌的分離鑒定與耐藥性試驗(yàn)

吳 白，楊 林，吳婷婷，劉 陽(yáng)，王彥紅，劉文博

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心 江蘇 揚(yáng)州 225009）

沙門菌感染可引起禽類各種各樣的急性和慢性疾病，感染禽也是經(jīng)食物鏈傳染給人的一個(gè)重要宿主。目前本菌屬至少已有2 500多個(gè)血清型，但只有約10%分自家禽，并且其中少數(shù)幾個(gè)血清型占了禽沙門菌分離株的絕大多數(shù)[1]。沙門菌在自然界的分布比較廣泛，有些是人及動(dòng)物共染的病原菌；在動(dòng)物中，多種畜禽及野生動(dòng)物均可被感染。自從抗生素的出現(xiàn)，沙門菌曾得到有效的控制，但是隨著抗生素的長(zhǎng)期使用，越來(lái)越多的耐藥菌株出現(xiàn)，使得本病的發(fā)病率和死亡率都不斷上升，一方面制約養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展；另一方面導(dǎo)致全世界人沙門菌感染逐漸上升，尤其是食物中毒不斷增多[2-3]。因此，為控制耐藥性沙門菌感染的蔓延，研究畜牧業(yè)中抗菌藥物的使用造成沙門菌耐藥性的變化，加大對(duì)沙門菌耐藥性檢測(cè)力度是非常必要的。為了能夠更好地控制其在家禽中的傳播，我們對(duì)疑似沙門菌的病料進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其流行特點(diǎn)和耐藥性進(jìn)行分析，為有效防治沙門菌感染提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，按通用的組方自行配制。其中麥康凱瓊脂粉，購(gòu)自上海中科昆蟲(chóng)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；瓊脂粉與氯化鈉，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨與胰酶，購(gòu)自O(shè)XOID公司；腸桿菌科細(xì)菌生化管和藥敏試紙，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；沙門菌屬診斷血清，購(gòu)自中國(guó)生物技術(shù)集團(tuán)公司蘭州生物制品研究所；16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit，購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 細(xì)菌分離 無(wú)菌采集2012年2月-7月送檢禽類的肝臟、心、卵等病料劃線接種于血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)24～48 h后，觀察結(jié)果。取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)及染色特性。

1.3 生化試驗(yàn) 取純化的菌株接種于腸桿菌科細(xì)菌生化管，37℃培養(yǎng)24～48 h。利用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管對(duì)所分離菌株進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定。

1.4 血清型鑒定 取潔凈的玻片，加少量沙門菌診斷血清，再用滅菌的接種環(huán)挑取純化的單個(gè)菌落與血清充分混勻。2 min內(nèi)觀察是否有凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，根據(jù)鑒定出的O抗原和H抗原，查閱Kauffman-White沙門菌抗原式即可確定被檢菌的菌型。

1.5 16S rDNA基因測(cè)序法 將分離細(xì)菌采用煮沸裂解法制備細(xì)菌基因組DNA模板，按照16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit方法操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定后，切膠送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序；將測(cè)定的序列在NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST）進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，鑒定細(xì)菌種屬。同時(shí)將15株分離菌的16S rDNA基因序列和參考株CQ0709用MEGA version 4軟件分析[5]。

1.6 藥敏試驗(yàn) 采用世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的Kirby-Bauer法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS，2009）公布的標(biāo)準(zhǔn)。藥敏紙片：頭孢曲松鈉（30 μg/片）、諾氟沙星（10 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、丁胺卡那霉素（30 μg/片）、復(fù)方新諾明（23.75 μg/片）、痢特靈（300 μg/片）、羅美沙星（10 μg/片）、美洛西林（75 μg/片）、多粘菌素 B（300 μ/片）、萘啶酸（30 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、左氧氟沙星（5 μg/片）、慶大霉素（10 μg/片）、強(qiáng)力霉素（30 μg/片）、鏈霉素（10 μg/片）。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離 從送檢病料中分離得到的15株細(xì)菌，在血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂上長(zhǎng)出乳白色、圓潤(rùn)菌落；在麥康凱瓊脂上培養(yǎng)48 h可見(jiàn)灰白色菌落，生長(zhǎng)緩慢。純化后的15株分離菌株分別命名為：S 01、S 02、S 03、S 04、S 05、S 06、S 07、S 08、S 09、S 10、S 11、S 12、S 13、S 14、S 15。S 01～S 08來(lái)源于雞，S 09～S 12來(lái)源于鵝，S 13為來(lái)源于鷓鴣，S 14來(lái)源于鴿，S 15來(lái)源于鴨。無(wú)菌采取在麥康凱板上純化的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，鏡檢可見(jiàn)革蘭陰性桿菌，多為散在排列。

2.2 生化試驗(yàn) 15株分離菌株都能發(fā)酵葡萄糖、果糖、甘露醇，不發(fā)酵乳糖、蔗糖，賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、甲基紅（M-R）試驗(yàn)陽(yáng)性，不水解尿素，不產(chǎn)吲哚，V-P試驗(yàn)陰性。有1株能發(fā)酵麥芽糖，但不產(chǎn)生硫化氫；有7株能發(fā)酵麥芽糖和產(chǎn)生硫化氫；其余的都不發(fā)酵麥芽糖，不產(chǎn)生硫化氫。分離菌的生化結(jié)果顯示，其基本符合沙門菌的特性。

2.3 血清型鑒定 15株疑似沙門菌其血清型與鼠傷寒沙門菌、傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、雞白痢的抗原模式基本相一致，初步判定分離菌株血清型為7株鼠傷寒沙門菌，5株傷寒沙門菌，2株腸炎沙門菌，1株雞白痢/雞傷寒沙門菌。

2.4 16S rDNA基因測(cè)序法 用16S rDNA試劑盒擴(kuò)增分離菌的16S rDNA片段后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將500 bp的目的片段切膠經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序；將測(cè)定的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，結(jié)果結(jié)合生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)確定所分離細(xì)菌血清型：S 01、S 09、S 10、S 11、S 12、S 14、S 15為鼠傷寒沙門菌；S 02、S 03、S 04、S 05、S 13為傷寒沙門菌；S 06、S 08為腸炎沙門菌；S 07為雞白痢沙門菌。參考株腸炎沙門菌株CQ0709來(lái)自于GenBank序列號(hào)為FJ465088.1，15株分離菌的16S rDNA序列上傳GenBank后獲取相應(yīng)的序列號(hào)：S01-S15分別為JX888143，JX888149，JX888151-JX8881 63。15株沙門菌16S rDNA序列同源性達(dá)97%以上（圖1）。

2.5 藥敏試驗(yàn) 15株細(xì)菌對(duì)15種藥物的耐藥性根據(jù)所選擇抗菌藥物的抑菌圈大小與敏感標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離細(xì)菌對(duì)鏈霉素、萘啶酸、強(qiáng)力霉素、美洛西林、諾氟沙星、痢特靈、慶大霉素、復(fù)方新諾明、羅美沙星、卡那霉素、多粘菌素B、左氧氟沙星、丁胺卡那霉素、氯霉素、頭孢曲松鈉的耐藥率分別為100.00%、100.00%、60.00%、60.00%、53.33%、40.00%、40.00%、40.00%、33.33%、33.33%、26.67%、26.67%、20.00%、20.00%、6.67%。

3 討論

3.1 根據(jù)送檢病料的的臨床檢查和病理剖檢情況，分離菌株的培養(yǎng)特性、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生化特性以及應(yīng)用16S rDNA基因測(cè)序法快速鑒定分離菌株顯示15株為沙門菌。血清型鑒定結(jié)果為7株鼠傷寒沙門菌，5株傷寒沙門菌，2株腸炎沙門菌和1株雞白痢沙門菌。除了具備沙門菌的基本生化特點(diǎn)之外，7株鼠傷寒沙門菌均發(fā)酵麥芽糖和產(chǎn)硫化氫；然而5株傷寒沙門菌僅1株發(fā)酵麥芽糖，均不產(chǎn)硫化氫；此外，其中1株分離自雞的鼠傷寒沙門菌能發(fā)酵蔗糖，蔗糖生化試驗(yàn)陽(yáng)性率極低，對(duì)我國(guó)19729株沙門菌進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)其僅為0.04%[5]。本試驗(yàn)的臨床分離菌株中，鼠傷寒沙門菌和傷寒沙門菌為主要血清型。鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌屬于泛嗜性沙門菌，感染的宿主范圍廣，能引起各種動(dòng)物的沙門菌感染，也是引起人類食物中毒的主要病原之一。雞白痢沙門菌可以感染各種年齡雞，以雛雞為主。目前，雞白痢的流行呈世界性分布，各地常有流行，該病的傳播主要是通過(guò)病禽和帶菌禽，也可經(jīng)過(guò)種蛋垂直傳播。

3.2 本試驗(yàn)主要對(duì)分離株進(jìn)行了15種藥物的耐藥性試驗(yàn)，分離菌株對(duì)鏈霉素、萘啶酸、強(qiáng)力霉素、諾氟沙星、美洛西林的耐藥性較強(qiáng)，對(duì)鏈霉素和萘啶酸耐藥率高達(dá)100%，根據(jù)送檢病例用藥調(diào)查可知養(yǎng)殖戶在飼養(yǎng)過(guò)程中較多地使用了喹諾酮類和氨基糖苷類藥物，研究結(jié)果進(jìn)一步映證了分離株對(duì)喹諾酮類和氨基糖苷類等藥物耐藥率較高。對(duì)于沒(méi)有用過(guò)的藥物，如頭孢曲松鈉、丁胺卡那霉素等耐藥率則很低或均敏感，說(shuō)明耐藥菌株的出現(xiàn)與長(zhǎng)期使用該類藥物有一定的相關(guān)性，建議臨床上對(duì)沙門菌的治療不用此類藥物。沙門菌的耐藥性具有較復(fù)雜的特征，且耐藥程度有逐年上升的趨勢(shì)[7]，因而在臨床上對(duì)于禽源沙門菌的防治要做好預(yù)防措施，合理使用藥物，結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇高敏藥物，并且做好定期更換藥物、配合用藥，降低其對(duì)各類藥物的耐藥性，從而能對(duì)沙門菌進(jìn)行有效的防治。

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[3]李婷婷.美國(guó)再次爆發(fā)活禽引發(fā)的沙門氏菌疫情[J].中國(guó)禽業(yè)導(dǎo)刊，2012，29（15）：57.

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