豬流行性腹瀉病毒野毒株/疫苗株RT-PCR鑒別診斷方法的建立

李長龍，陳建飛，張 鑫，時洪艷，馮 力

（中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室豬傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001）

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的以仔豬腹瀉、嘔吐和脫水為主要癥狀的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。PED在世界范圍內廣泛流行，1978年首次在英國和比利時暴發[1-2]。我國PED流行也非常嚴重，自2010年下半年開始同豬傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒等混合感染呈現大規模流行?，F地病料檢測結果表明，2010-2011年我國部分地區PEDV的感染率高達54.7%，遠高于豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）(38.1%)和豬輪狀病毒（PoRV）（5.04%）的感染率[3]，給我國養豬業造成了巨大的經濟損失。

PEDV其基因組從5′～3′依次編碼復制酶多聚蛋白1ab、纖突蛋白（S）、ORF3蛋白、小膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。其中ORF3基因是PEDV基因組中的惟一輔助基因，也是造成強弱毒差異的主要基因[4-5]，疫苗毒在ORF3內部存在堿基缺失現象。

目前國內外PEDV商品化疫苗毒株均為基因缺失弱毒疫苗，如我國的CV777株，日本的P-5V株和韓國的KPED-9和DR13株等[6]。這3個疫苗毒株均是從患病仔豬分離到強毒后經Vero細胞連續傳代致弱而成。通過分析ORF3基因，在其缺失區域兩端設計合理的引物，采用RT-PCR方法可對野毒和疫苗毒感染進行鑒定（引物所在位置見圖1）。我們對黑龍江、吉林等地區送檢的15份病料進行了檢測，發現PEDV呈現混合感染，但仍以野毒感染為主，從而為PEDV的診斷和免疫提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 來自黑龍江、吉林等地有腹瀉、嘔吐等癥狀仔豬的小腸和糞便，共15份。

1.2 陽性質粒 PEDV野毒株（CH/S株）和疫苗株的ORF3基因陽性質粒均由本實驗室克隆、保存；在本試驗中做為陽性對照模板。

1.3 主要試劑 TRIZol總RNA提取試劑，購自Invitrogen公司；鼠源反轉錄酶（M-MLV）及反轉錄試劑，購自Promega公司；EmeraldAmp PCR Master Mix，購自TaKaRa公司。

1.4 引物設計 根據PEDV野毒/疫苗毒ORF3基因序列比對后結果在疫苗毒缺失區域兩端用Primer 5.0設計引物，引物序列：PORF3-U：5′-GGAGCTCAATGTAGTTCCAA-3′(24 881～24 900)；PORF3-L：5′-AGCTGCTTTACCATTGAGAA-3′(25 180～25 199)，由哈爾濱博仕生物技術有限公司合成。預期野毒擴增長度為319 bp，疫苗毒擴增長度為270 bp。

1.5 特異性檢驗 以PEDV野毒株CH/S和疫苗株ORF3陽性質粒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒和豬繁殖和呼吸綜合征病毒的cDNA為模板進行PCR擴增。反應在20 μL體系中進行，預混酶10 μL；cDNA 1 μL；上下游引物各1 μL；水7 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 10 min。

1.6 病料處理和總RNA提取 取適量小腸內容物或糞便放入1.5 mL滅菌EP管中，加入800 μL PBS混懸后12 000 r/min，（4 ℃）離心10 min，取上清，按照TRIZol說明書提取總RNA。

1.7 cDNA合成和PCR檢測 按照鼠源反轉錄酶（M-MLV）及反轉錄試劑說明書合成，以合成的cDNA模板進行PCR擴增。反應體系和反應條件同1.5。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果

2.1 PEDV野毒株和疫苗株ORF3基因的擴增 以PEDV 野毒 CH/S（GU372733）和 PEDV 疫 苗 毒 株CV777細胞適應毒（GU372744）ORF3基因的陽性質粒為模板進行PCR擴增，經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，野毒擴增片段為319 bp，疫苗毒擴增片段為270 bp，與預期大小相符，差異明顯（圖2）。

2.2 特異性擴增 以已檢測確診的TGEV、PoRV、PRRSV、PRV、SFV陽性病料的cDNA為模板進行擴增。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示沒有目的條帶，而PEDV野毒和疫苗毒均有預期大小的目的條帶，表明本研究所設計的鑒別引物擴增效果特異性較好（圖3）。

2.3 病料cDNA擴增 對2012年10月份至2013年2月份送檢的15份疑似PEDV感染豬病料cDNA為模板進行擴增，經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，15份病料均能檢測到PEDV，其中13份為野毒感染，2份為疫苗毒感染(圖4)。

3 討論

PEDV是引起仔豬腹瀉的重要病原之一，而且新生仔豬一旦發病，死亡率往往接近100%，給養豬業帶來極大的經濟損失，自2010年下半年以來，我國出現大范圍的豬流行性腹瀉疫情，而且疫情多持續存在。經本實驗室所檢測病料數據的統計結果顯示，PEDV感染率明顯高于另外兩個豬病毒性腹瀉病原-TGEV和PoRV[7]。

圖4 病料cDNA擴增

PEDV的ORF3基因是PEDV毒力的決定性因素之一[8]。弱毒普遍都是在ORF3基因中連續缺失數十個堿基，而且在弱毒缺失區域周圍的序列卻相對保守，不同毒株的ORF3基因相似性達到97.8%[8-9]。這也為PEDV野毒和疫苗毒的鑒定提供了一個很好的基礎。

目前已有多個實驗室建立了多種PEDV病毒檢測方法[10-11]。但是目前這些對PEDV病原的檢測也多無法區別野毒和疫苗毒。本研究利用PEDV強弱毒株之間自然存在的ORF3基因部分缺失設計引物進行檢測，既可以對PEDV病原進行檢測，還可以通過PCR產物大小進行野毒疫苗毒鑒別診斷，而且費用相對較低，可進行大規模流行病學調查。對PEDV的免疫和強毒感染情況進行區分，有助于減少免疫豬被淘汰的可能，降低經濟損失。

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