1株亞硒酸鈉還原菌的分離及初步研究

王健等

摘要：從湖北恩施漁塘壩高硒土壤中分離篩選出1株能夠還原Na2SeO3的細菌EGS12，16S rDNA測序鑒定為嗜麥芽寡養單胞菌。開展Na2SeO3對細菌菌株生長影響的試驗研究，結果表明，該菌株在2 mmol/L Na2SeO3的LB培養基中 37 ℃ 搖床培養87 h，對Na2SeO3的還原率為97.31%。

關鍵詞：亞硒酸鈉；亞硒酸鹽；還原；寡養單胞菌

中圖分類號： Q93-331文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0370-03

收稿日期：2013-12-19

作者簡介：王健（1989—），男，湖南衡陽人，碩士，從事生物資源綜合利用研究。E-mail：260598984@qq.com。

通信作者：吳永堯，教授。E-mail：yywu357@sohu.com。硒是一種生命必需微量元素，但高濃度的硒毒性較強，容易造成環境污染。湖北恩施漁塘壩是中國典型高硒地區之一，也是世界上發生過人群硒中毒的暴發性流行病區。在硒4種價態中（分別為-2、0、+4、+6），亞硒酸鹽的毒性最大，是污染環境的主要物質之一[1-2]。亞硒酸鹽還原菌可以將亞硒酸鹽還原為紅色的單質硒，可用于某些硒環境污染的生物治理，其產物單質硒在生物補硒方面也有應用價值。另外，單質納米硒有很活躍的光學電子特性，是未來“納米技術”的良好研究材料[3]。嗜麥芽寡養單胞菌是一種在自然界廣泛分布的非發酵型革蘭氏陰性桿菌，是人類一種重要條件致病菌[4]，學者們大多集中在醫學如耐藥性、致病機制等方面開展研究，尚未有寡養單胞菌具有還原Na2SeO3能力的研究報道。

1材料與方法

1.1主要儀器和試劑

16S rDNA細菌通用引物27-F：5′-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′，1392-R：5′-ACG GGC GGT GTG TRC-3′，由北京六合華大基因股份有限公司合成；單質硒粉，純度為99.9%；亞硒酸鈉（Na2SeO3）及其他化學試劑，均為分析純；TU-1810紫外可見分光光度計，由北京普析通用有限公司生產。

1.2土樣采集及處理

1.2.1樣品采集土樣2013年9月采自湖北省恩施市新塘鄉漁塘壩，以東經109°46′19″～109°47′24″、北緯30°10′24″～30°11′02″ 的硒礦洞為起點，向北每間隔500 m采集1個土樣，深度為5～25 cm。記錄上層植被情況，多點采樣混合。

1.2.2樣品處理及保存壓碎，去除石塊、植物、根莖、落葉等，混勻，裝入聚乙烯自封袋中，于冰盒中運輸及保存。

1.3培養條件及分離方法

2.5菌株還原能力初探

由圖4可見，在12～48 h內，菌株EGS12對Na2SeO3的還原率提升并不明顯，48 h后還原率大大提升。菌株EGS12對Na2SeO3的還原是從生長就開始的，到了穩定期后進行大量還原，這說明菌株對Na2SeO3的還原和菌體生長呈正相關性。

3結論與討論

硒是一種營養劑量和毒性劑量范圍很窄的微量元素[7]。

利用微生物還原Na2SeO3而產生納米紅色單質硒，比傳統無機硒和有機硒更高效、更具有高安全性。本研究從高硒區土壤分離篩選到高耐硒和高還原率的嗜麥芽寡養單胞菌，能在耗氧情況下利用有機碳源，把培養基所含的Na2SeO3還原成紅色單質硒。當LB培養基中添加2 mmol/LNa2SeO3時，僅用4 d不到的時間就幾乎把Na2SeO3全部還原完。雖然Na2SeO3對微生物都有毒性作用，但菌株EGS12竟然能生長在60 mmol/L篩選分離平板中，其耐硒能力遠高于其他還原硒菌種，如枯草芽孢桿菌MIC為1 mmol/L、大腸桿菌MIC為5.8 mmol/L、慢生大豆根瘤菌MIC為6～12 mmol/L、球型紅細菌MIC為2.9～4.6 mmol/L等[8]。 經鑒定，篩選出的菌株為嗜麥芽寡養單胞菌，其還原Na2SeO3的能力國內尚未見報道，對Na2SeO3的還原位點及還原機制還有待進一步研究。

參考文獻：

[1]王東亮，肖敏，錢衛，等. 細菌還原氧化態硒產生紅色單質硒的研究進展[J]. 微生物學報，2007，47（3）：554-557.

[2]Zhang J S，Wang H L，Bao Y P，et al. Nano red elemental selenium has no size effect in the induction of seleno-enzymes in both cultured cells and mice[J]. Life Sciences，2004，75（2）：237-244.

[3]高學云，張勁松，張立德. 納米紅色元素硒的急性毒性和生物利用性[J]. 衛生研究，2000，29（1）：57-58.

[4]Denton M，Kerr K G. Microbiological and clinical aspects of infection associated with Stenotrophomonas maltophilia[J]. Clinical Microbio-logy Reviews，1998，11（1）：57-80.

[5]Biswas K C，Barton L L，Tsui W L，et al. A novel method for the measurement of elemental selenium produced by bacterial reduction of selenite[J]. Journal of Microbiological Methods，2011，86（2）：140-144.

[6]耿毅，汪開毓，陳德芳，等. 嗜麥芽寡養單胞菌研究進展[J]. 動物醫學進展，2006，27（5）：28-31.

[7]鄭世學，粟靜，王瑞，等. 硒是雙刃劍？——談微生物中的硒代謝[J]. 華中農業大學學報，2013，32（5）：1-8.

[8]蔣華東，何曉紅，張禮霞，等. 一株假單胞菌好氧還原亞硒酸鈉為紅色單質硒[J]. 微生物學報，2010，50（10）：1347-1352.

摘要：從湖北恩施漁塘壩高硒土壤中分離篩選出1株能夠還原Na2SeO3的細菌EGS12，16S rDNA測序鑒定為嗜麥芽寡養單胞菌。開展Na2SeO3對細菌菌株生長影響的試驗研究，結果表明，該菌株在2 mmol/L Na2SeO3的LB培養基中 37 ℃ 搖床培養87 h，對Na2SeO3的還原率為97.31%。

關鍵詞：亞硒酸鈉；亞硒酸鹽；還原；寡養單胞菌

中圖分類號： Q93-331文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0370-03

收稿日期：2013-12-19

作者簡介：王?。?989—），男，湖南衡陽人，碩士，從事生物資源綜合利用研究。E-mail：260598984@qq.com。

通信作者：吳永堯，教授。E-mail：yywu357@sohu.com。硒是一種生命必需微量元素，但高濃度的硒毒性較強，容易造成環境污染。湖北恩施漁塘壩是中國典型高硒地區之一，也是世界上發生過人群硒中毒的暴發性流行病區。在硒4種價態中（分別為-2、0、+4、+6），亞硒酸鹽的毒性最大，是污染環境的主要物質之一[1-2]。亞硒酸鹽還原菌可以將亞硒酸鹽還原為紅色的單質硒，可用于某些硒環境污染的生物治理，其產物單質硒在生物補硒方面也有應用價值。另外，單質納米硒有很活躍的光學電子特性，是未來“納米技術”的良好研究材料[3]。嗜麥芽寡養單胞菌是一種在自然界廣泛分布的非發酵型革蘭氏陰性桿菌，是人類一種重要條件致病菌[4]，學者們大多集中在醫學如耐藥性、致病機制等方面開展研究，尚未有寡養單胞菌具有還原Na2SeO3能力的研究報道。

1材料與方法

1.1主要儀器和試劑

16S rDNA細菌通用引物27-F：5′-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′，1392-R：5′-ACG GGC GGT GTG TRC-3′，由北京六合華大基因股份有限公司合成；單質硒粉，純度為99.9%；亞硒酸鈉（Na2SeO3）及其他化學試劑，均為分析純；TU-1810紫外可見分光光度計，由北京普析通用有限公司生產。

1.2土樣采集及處理

1.2.1樣品采集土樣2013年9月采自湖北省恩施市新塘鄉漁塘壩，以東經109°46′19″～109°47′24″、北緯30°10′24″～30°11′02″ 的硒礦洞為起點，向北每間隔500 m采集1個土樣，深度為5～25 cm。記錄上層植被情況，多點采樣混合。

1.2.2樣品處理及保存壓碎，去除石塊、植物、根莖、落葉等，混勻，裝入聚乙烯自封袋中，于冰盒中運輸及保存。

1.3培養條件及分離方法

2.5菌株還原能力初探

由圖4可見，在12～48 h內，菌株EGS12對Na2SeO3的還原率提升并不明顯，48 h后還原率大大提升。菌株EGS12對Na2SeO3的還原是從生長就開始的，到了穩定期后進行大量還原，這說明菌株對Na2SeO3的還原和菌體生長呈正相關性。

3結論與討論

硒是一種營養劑量和毒性劑量范圍很窄的微量元素[7]。

利用微生物還原Na2SeO3而產生納米紅色單質硒，比傳統無機硒和有機硒更高效、更具有高安全性。本研究從高硒區土壤分離篩選到高耐硒和高還原率的嗜麥芽寡養單胞菌，能在耗氧情況下利用有機碳源，把培養基所含的Na2SeO3還原成紅色單質硒。當LB培養基中添加2 mmol/LNa2SeO3時，僅用4 d不到的時間就幾乎把Na2SeO3全部還原完。雖然Na2SeO3對微生物都有毒性作用，但菌株EGS12竟然能生長在60 mmol/L篩選分離平板中，其耐硒能力遠高于其他還原硒菌種，如枯草芽孢桿菌MIC為1 mmol/L、大腸桿菌MIC為5.8 mmol/L、慢生大豆根瘤菌MIC為6～12 mmol/L、球型紅細菌MIC為2.9～4.6 mmol/L等[8]。 經鑒定，篩選出的菌株為嗜麥芽寡養單胞菌，其還原Na2SeO3的能力國內尚未見報道，對Na2SeO3的還原位點及還原機制還有待進一步研究。

參考文獻：

[1]王東亮，肖敏，錢衛，等. 細菌還原氧化態硒產生紅色單質硒的研究進展[J]. 微生物學報，2007，47（3）：554-557.

[2]Zhang J S，Wang H L，Bao Y P，et al. Nano red elemental selenium has no size effect in the induction of seleno-enzymes in both cultured cells and mice[J]. Life Sciences，2004，75（2）：237-244.

[3]高學云，張勁松，張立德. 納米紅色元素硒的急性毒性和生物利用性[J]. 衛生研究，2000，29（1）：57-58.

[4]Denton M，Kerr K G. Microbiological and clinical aspects of infection associated with Stenotrophomonas maltophilia[J]. Clinical Microbio-logy Reviews，1998，11（1）：57-80.

[5]Biswas K C，Barton L L，Tsui W L，et al. A novel method for the measurement of elemental selenium produced by bacterial reduction of selenite[J]. Journal of Microbiological Methods，2011，86（2）：140-144.

[6]耿毅，汪開毓，陳德芳，等. 嗜麥芽寡養單胞菌研究進展[J]. 動物醫學進展，2006，27（5）：28-31.

[7]鄭世學，粟靜，王瑞，等. 硒是雙刃劍？——談微生物中的硒代謝[J]. 華中農業大學學報，2013，32（5）：1-8.

[8]蔣華東，何曉紅，張禮霞，等. 一株假單胞菌好氧還原亞硒酸鈉為紅色單質硒[J]. 微生物學報，2010，50（10）：1347-1352.

摘要：從湖北恩施漁塘壩高硒土壤中分離篩選出1株能夠還原Na2SeO3的細菌EGS12，16S rDNA測序鑒定為嗜麥芽寡養單胞菌。開展Na2SeO3對細菌菌株生長影響的試驗研究，結果表明，該菌株在2 mmol/L Na2SeO3的LB培養基中 37 ℃ 搖床培養87 h，對Na2SeO3的還原率為97.31%。

關鍵詞：亞硒酸鈉；亞硒酸鹽；還原；寡養單胞菌

中圖分類號： Q93-331文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0370-03

收稿日期：2013-12-19

作者簡介：王?。?989—），男，湖南衡陽人，碩士，從事生物資源綜合利用研究。E-mail：260598984@qq.com。

通信作者：吳永堯，教授。E-mail：yywu357@sohu.com。硒是一種生命必需微量元素，但高濃度的硒毒性較強，容易造成環境污染。湖北恩施漁塘壩是中國典型高硒地區之一，也是世界上發生過人群硒中毒的暴發性流行病區。在硒4種價態中（分別為-2、0、+4、+6），亞硒酸鹽的毒性最大，是污染環境的主要物質之一[1-2]。亞硒酸鹽還原菌可以將亞硒酸鹽還原為紅色的單質硒，可用于某些硒環境污染的生物治理，其產物單質硒在生物補硒方面也有應用價值。另外，單質納米硒有很活躍的光學電子特性，是未來“納米技術”的良好研究材料[3]。嗜麥芽寡養單胞菌是一種在自然界廣泛分布的非發酵型革蘭氏陰性桿菌，是人類一種重要條件致病菌[4]，學者們大多集中在醫學如耐藥性、致病機制等方面開展研究，尚未有寡養單胞菌具有還原Na2SeO3能力的研究報道。

1材料與方法

1.1主要儀器和試劑

16S rDNA細菌通用引物27-F：5′-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′，1392-R：5′-ACG GGC GGT GTG TRC-3′，由北京六合華大基因股份有限公司合成；單質硒粉，純度為99.9%；亞硒酸鈉（Na2SeO3）及其他化學試劑，均為分析純；TU-1810紫外可見分光光度計，由北京普析通用有限公司生產。

1.2土樣采集及處理

1.2.1樣品采集土樣2013年9月采自湖北省恩施市新塘鄉漁塘壩，以東經109°46′19″～109°47′24″、北緯30°10′24″～30°11′02″ 的硒礦洞為起點，向北每間隔500 m采集1個土樣，深度為5～25 cm。記錄上層植被情況，多點采樣混合。

1.2.2樣品處理及保存壓碎，去除石塊、植物、根莖、落葉等，混勻，裝入聚乙烯自封袋中，于冰盒中運輸及保存。

1.3培養條件及分離方法

2.5菌株還原能力初探

由圖4可見，在12～48 h內，菌株EGS12對Na2SeO3的還原率提升并不明顯，48 h后還原率大大提升。菌株EGS12對Na2SeO3的還原是從生長就開始的，到了穩定期后進行大量還原，這說明菌株對Na2SeO3的還原和菌體生長呈正相關性。

3結論與討論

硒是一種營養劑量和毒性劑量范圍很窄的微量元素[7]。

利用微生物還原Na2SeO3而產生納米紅色單質硒，比傳統無機硒和有機硒更高效、更具有高安全性。本研究從高硒區土壤分離篩選到高耐硒和高還原率的嗜麥芽寡養單胞菌，能在耗氧情況下利用有機碳源，把培養基所含的Na2SeO3還原成紅色單質硒。當LB培養基中添加2 mmol/LNa2SeO3時，僅用4 d不到的時間就幾乎把Na2SeO3全部還原完。雖然Na2SeO3對微生物都有毒性作用，但菌株EGS12竟然能生長在60 mmol/L篩選分離平板中，其耐硒能力遠高于其他還原硒菌種，如枯草芽孢桿菌MIC為1 mmol/L、大腸桿菌MIC為5.8 mmol/L、慢生大豆根瘤菌MIC為6～12 mmol/L、球型紅細菌MIC為2.9～4.6 mmol/L等[8]。 經鑒定，篩選出的菌株為嗜麥芽寡養單胞菌，其還原Na2SeO3的能力國內尚未見報道，對Na2SeO3的還原位點及還原機制還有待進一步研究。

參考文獻：

[1]王東亮，肖敏，錢衛，等. 細菌還原氧化態硒產生紅色單質硒的研究進展[J]. 微生物學報，2007，47（3）：554-557.

[2]Zhang J S，Wang H L，Bao Y P，et al. Nano red elemental selenium has no size effect in the induction of seleno-enzymes in both cultured cells and mice[J]. Life Sciences，2004，75（2）：237-244.

[3]高學云，張勁松，張立德. 納米紅色元素硒的急性毒性和生物利用性[J]. 衛生研究，2000，29（1）：57-58.

[4]Denton M，Kerr K G. Microbiological and clinical aspects of infection associated with Stenotrophomonas maltophilia[J]. Clinical Microbio-logy Reviews，1998，11（1）：57-80.

[5]Biswas K C，Barton L L，Tsui W L，et al. A novel method for the measurement of elemental selenium produced by bacterial reduction of selenite[J]. Journal of Microbiological Methods，2011，86（2）：140-144.

[6]耿毅，汪開毓，陳德芳，等. 嗜麥芽寡養單胞菌研究進展[J]. 動物醫學進展，2006，27（5）：28-31.

[7]鄭世學，粟靜，王瑞，等. 硒是雙刃劍？——談微生物中的硒代謝[J]. 華中農業大學學報，2013，32（5）：1-8.

[8]蔣華東，何曉紅，張禮霞，等. 一株假單胞菌好氧還原亞硒酸鈉為紅色單質硒[J]. 微生物學報，2010，50（10）：1347-1352.