兔、豚鼠動脈粥樣硬化模型的建立

卞 勇，鞠曉云，范乃兵

（南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023）

動脈粥樣硬化及其并發癥嚴重危害人類健康。動脈粥樣硬化的發病機制復雜，是多種因素長期共同作用的結果。探明動脈粥樣硬化發病機理、篩選研究有效治療藥物是國內外研究的重點和難點，而建立一種與人類動脈粥樣硬化發病機制、臨床表現相一致或接近的整體動物模型則是進行上述研究的關鍵。近年來，國內外學者使用鳥類、鼠類、兔、豬、非人靈長類動物和轉基因動物等用于實驗性動脈粥樣硬化的研究，在取得諸多進展的同時，也逐步發現模型的缺陷和不足，限制了其應用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

兔，體重2.5～3.0kg，雄性，金陵種兔場，合格證號：SCXK（蘇）2012-0003。豚鼠，體重280～310g，雄性，南京江寧區青龍山動物繁殖場，合格證號：SCXK（蘇）2012-0008。

1.2 藥物及試劑

總膽固醇試劑盒：南京建成生物研究所，批號：20130917。甘油三酯試劑盒：南京建成生物研究所，批號：20130822。高密度脂蛋白試劑盒：南京建成生物研究所，批號：20131024。低密度脂蛋白試劑盒：南京建成生物研究所，批號：20130915。一氧化氮試劑盒：南京建成生物研究所，批號：20130825。腫瘤壞死因子ELISA 試劑盒：南京建成生物研究所，批號：20130711。高脂飼料：1%膽固醇，0.3%膽酸鈉，10%豬油，88.7%普通飼料。

1.3 試驗儀器

Thermo Multiskan Go酶標儀；日立7100型全自動生化分析儀（751-0082）。

2 實驗方法［1～6］

將豚鼠和兔子分別隨機分為：正常對照組（飼普通飼料）、模型組（1%膽固醇，0.3%膽酸鈉，10%豬油，88.7%普通飼料），每組10只，連續飼養8周。在第4、8周，豚鼠眼眶取血，兔耳緣靜脈取血，備用。于末次飼養后禁食不禁水8h，用3%戊巴比妥鈉麻醉后將動物固定于手術臺，頸總動脈取血，備用。分離主動脈，10%中性福爾馬林固定，做組織病理學檢測。

3 檢測指標

3.1 血脂檢測

血液3000r／min，離心10min，吸取上層血清，用日立7100型全自動生化分析儀檢測血清中血清TG、TC、HDL、LDL含量。

3.2 血清NO、TNF-α含量檢測

血液3000r／min，離心10min，吸取上層血清，按試劑說明檢測NO、TNF-α含量。

3.3 主動脈組織病理學檢測

取主動脈，10%福爾馬林固定。石蠟包埋切片，切片厚約4～5μm，HE染色。由病理專業研究人員閱片，光鏡下觀察動脈壁（內膜、中膜）的組織學變化。

4 統計學方法

5 實驗結果

5.1 對血脂的影響

高脂飼料喂養4 周后，兔模型組TC、TG、LDL 明顯升高，與正常組比較有顯著性差異，而HDL 降低，與兔模型組比較有顯著性差異（P＜0.05，0.01）。豚鼠模型組血脂指標有所改變，但與豚鼠模型組比較無顯著性差異（P＞0.05）。見表1。高脂飼料喂養8周后，兔模型組TC、TG、LDL 明顯升高，與兔正常組比較有顯著性差異，而HDL 降低，與兔模型組比較有顯著性差異（P＜0.05，0.01）。豚鼠模型組TC、TG、LDL、HDL 升高，與豚鼠模型組比較有顯著性差異（P＜0.05，0.01）。見表2。

表1 高脂喂養4周后對血清TC、TG、HDL、LDL的影響（±s，n=10）

表1 高脂喂養4周后對血清TC、TG、HDL、LDL的影響（±s，n=10）

注：模型組與正常組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

表2 高脂喂養8周后對血清TC、TG、HDL、LDL的影響（±s，n=10）

表2 高脂喂養8周后對血清TC、TG、HDL、LDL的影響（±s，n=10）

注：模型組與正常組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

5.2 對血清NO、TNF-α含量的影響

高脂飼料喂養8 周后，兔模型組NO、TNF-α明顯升高，與兔正常組比較有顯著性差異（P＜0.05，0.01）。豚鼠型組NO、TNF-α明顯升高，與豚鼠正常組比較有顯著性差異（P＜0.05）。見表3。

表3 對血清NO、TNF-α含量的影響（±s，n=10）

表3 對血清NO、TNF-α含量的影響（±s，n=10）

注：模型組與正常組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

5.3 主動脈組織病理學檢測

（1）兔正常對照組：10／10只動脈內膜內皮細胞完整，排列整齊，內彈力膜清晰完好，中膜平滑肌細胞體積、排列正常，內膜及中膜均未見泡沫細胞及脂質沉積。見圖1。

（2）兔模型組：8／10只動脈內膜明顯增厚（++），纖維隆起明顯（++），內含大量泡沫細胞（++），內皮細胞腫脹、變性、部分缺失，內彈力膜斷裂、模糊（++），中膜增厚伴平滑肌細胞增生（++），胞體變大，排列紊亂，內膜及中膜均可見巨噬細胞。見圖2。

（3）豚鼠正常對照組：10／10 只各動脈內膜內皮細胞完整，排列整齊，內彈力膜清晰完好，中膜平滑肌細胞體積、排列正常，內膜及中膜均未見泡沫細胞及脂質沉積。見圖3。

（4）豚鼠模型組：7／10只動脈內膜輕度增厚（+），纖維輕度隆起（+），內含少量泡沫細胞（+），內皮細胞腫脹、變性、部分缺失，內彈力膜斷裂、模糊（+），中膜增厚伴平滑肌細胞增生，胞體變大，排列紊亂，內膜及中膜均可見巨噬細胞。見圖4。

圖1 兔正常組×200

圖2 兔模型組×200

圖3 豚鼠正常組×200

圖4 豚鼠模型組×200

6 討論

動脈粥樣硬化是動脈硬化中最重要的一個類型，基本損害是動脈內膜局部呈斑塊狀增厚，故又稱動脈粥樣硬化斑塊或簡稱斑塊，動脈粥樣硬化發病率很高，且累及全身動脈血管，主要累及主動脈、冠狀動脈、腦動脈、腎動脈、大、中型肌彈力型動脈，最終導致他們的管腔狹窄以致完全堵塞，使這些重要器官缺血缺氧、功能障礙以致機體死亡。動脈粥樣硬化是導致心臟疾病和中風的首要原因。

高脂血癥與AS的關系已經得到證實，AS的嚴重程度隨血漿膽固醇水平的升高而加重。LDL 是血漿膽固醇的主要存在形式，能在血漿內或動脈內膜下經自由基引發的脂質過氧化而轉變為氧化修飾的LDL（低密度脂蛋白ox-LDL）。生理狀態下，HDL促進膽固醇逆轉錄，抗炎抗氧化，抗血栓并促纖溶，具有抗AS 作用。所以血脂水平特別是LDL的升高和HDL的降低與AS發病率呈正相關。但最新的研究表明，在某些病理狀態下，HDL 抗動脈粥樣硬化作用受損，可促進動脈粥樣硬化的形成。所以血脂水平的檢測是評價AS病變的一個公認的、必不可少的指標。

本實驗在造模方式上采用高脂飼料喂養方式，對動物損傷小，形成病變與人類由膳食結構改變形成的動脈粥樣硬化類似。本實驗對照組動物整體狀況良好，實驗組動物隨時間推移而漸見疾病癥狀出現，其血脂水平明顯增高。兔模型組血粘度、血漿粘度升高，TC、TG、LDL、NO、TNF-α升高，HDL降低，與正常組比較有顯著性差異（P＜0.05，0.01）。豚鼠TC、TG、LDL、HDL、NO、TNF-α升高，與正常組比較有顯著性差異（P＜0.05，0.01）。兩種動物模型組組動脈病理檢測均不同程度出現動脈內膜明顯增厚，纖維隆起明顯，內皮細胞腫脹、變性、部分缺失，內彈力膜斷裂、模糊，中膜增厚伴平滑肌細胞增生，胞體變大，排列紊亂，內膜及中膜均可見巨噬細胞。兔動脈粥樣硬化誘導時間比豚鼠短，成模率比豚鼠高，病變更顯著。

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