乳桿菌A-2代謝產(chǎn)物對人舌鱗癌CAL-27細胞增殖與凋亡的初步研究

張國梁，吳 江，關(guān) 鍵，關(guān) 宏，李德超，王心彧

（1.佳木斯大學口腔醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154002；2.齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

口腔頜面部惡性腫瘤以癌最為常見，其中又以鱗狀細胞癌最多見，約占80%以上［1］。舌癌是最常見的口腔癌，容易發(fā)生早期頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移率較高［1，2］。目前舌癌的治療方式是以手術(shù)治療為主，以及術(shù)前、術(shù)后的化療來提高療效。但是傳統(tǒng)的化療通常存在著腫瘤細胞耐藥、化療藥物毒副作用等不利因素，因此從動植物、礦物質(zhì)、海洋生物等天然物質(zhì)中尋找高效低毒的治療惡性腫瘤的藥物已經(jīng)成為研究熱點。乳桿菌屬于益生菌［3］，通過發(fā)酵糖類、蛋白質(zhì)、脂類和氨基酸等，可以得到乳酸、乙酸、細菌素、過氧化氫、胞外多糖、胞外多聚糖、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑等代謝產(chǎn)物物質(zhì)，乳桿菌及其代謝產(chǎn)物具有抗感染、抗氧化、抗齲齒和抗腫瘤功能，并與細胞凋亡和細胞分化的調(diào)控有關(guān)［4］。實驗中乳桿菌A-2的代謝產(chǎn)物1（LSPM1）和代謝產(chǎn)物2（LSPM2））均為復雜的混合物，里面包含氨基酸、蛋白質(zhì)和游離的金屬離子等成分。本實驗主要目的是檢測該混合物對人舌鱗癌CAL-27細胞的抑制及誘導凋亡情況，混合物的抗癌有效成分仍需進一步研究，以便為篩選新的抗腫瘤生物活性劑提供更有利的實驗基礎(chǔ)。

1 實驗方法

1.1 實驗儀器

Annexin V-FITC／PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司），CO2培養(yǎng)箱，倒置熒光顯微鏡（X-50，Nikon），流式細胞分析儀（FACSCalibur型）。

1.2 實驗材料

乳桿菌A-2（Lactobacillus sp A-2）（齊齊哈爾醫(yī)學院提供），人舌鱗癌細胞CAL-27（協(xié)和醫(yī)科大學提供），DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）培養(yǎng)基，胎牛血清（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），MTT 試劑盒，吖啶橙（AO）染料（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），MRS（DeMan Rogosa-Sharpe）培養(yǎng)基，復原乳清培養(yǎng)基（乳清粉50g／L，碳酸鈣20g／L，pH6.0～6.5，121℃滅菌15min），復原乳清菊糖培養(yǎng)基（乳清粉50g／L，碳酸鈣20g／L，菊糖10g／L，pH6.0～6.5，121℃滅菌15min）。

1.3 乳桿菌A-2菌懸液的制備

乳桿菌A-2放入已添加MRS的15mL離心管中，放入37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)24h，以上步驟重復3次，72h后取出，再離心，取等體積的無菌生理鹽水（含10mM CaCl2）沖洗乳桿菌A-2沉淀2次，再離心，棄上清液，然后制備菌懸液，備用。

1.4 乳桿菌A-2代謝產(chǎn)物的制備

將上述菌懸液分別接種于復原乳清培養(yǎng)基和復原乳清菊糖培養(yǎng)基中，菌液濃度為1OD／mL，100r／min振蕩，放置于40℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，48h。然后取出菌液，離心，取上清液，經(jīng)過真空冷凍干燥分別得到凍干粉（乳桿菌A-2代謝產(chǎn)物LSPM1和LSPM2），-20℃保存，備用。

1.5 CAL-27細胞培養(yǎng)

CAL-27 細胞復蘇后，加入DMEM 培養(yǎng)基，放置于37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，12h，觀察細胞狀態(tài)。當細胞呈單層貼壁生長、80%～90%融合時，利用0.05%胰蛋白酶消化傳代。

1.6 MTT 法測定LSPM1和LSPM2對CAL-27細胞生長抑制率

將1.0×104／mL 的CAL-27細胞分別接種到96孔板中，每孔0.1mL，實驗組是濃度分別為1.875mg／mL、3.75mg／mL、7.5mg／mL、15mg／mL、30mg／mL 的LSPM1；陽性對照組是濃度1μg／mL的紫杉醇；空白對照組是只加培養(yǎng)液。置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，于終止培養(yǎng)前2h加入5mg／mL的MTT 溶液20μL，培養(yǎng)2h，離心，棄上清液，加入150μL 的DMSO，震蕩5～10min，直到完全溶解。測定570nm 的吸光度（A570nm）值，公式：細胞生長抑制率（%）=（1-實驗組A570nm值／空白對照組A570nm值）×100%。利用上述方法再測定LSPM2對CAL-27細胞生長抑制率。

1.7 熒光顯微鏡觀察CAL-27細胞的形態(tài)學變化

將2.4×105／mL CAL-27細胞懸液接種于放有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)中24h后，分別加入濃度為36mg／mL的LSPM1和36mg／mL的LSPM2，空白對照組只添入培養(yǎng)基，再置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中16h，取出蓋玻片，固定5min，吖啶橙染色5～10min，再用PBS沖洗后，在熒光顯微鏡下觀察。

1.8 流式細胞儀檢測

制備1.5×106／mLCAL-27細胞懸液，取2mL 接種于培養(yǎng)皿中。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱12h，分別加入濃度為36mg／mL LSPM1和36mg／mL LSPM2，繼續(xù)培養(yǎng)12h，然后用0.05%的胰蛋白酶消化，PBS沖洗2次，500μL 1×Binding Buffer懸浮細胞（1.0～1.5×106／mL）加入5μL Annexinv-FITC，輕輕混勻，于2～8℃避光條件下孵育15min，再加入5μLPI，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育5min，1h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.9 瓊脂糖凝膠電泳法分析

將3×106／mL 的CAL-27細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2培 養(yǎng) 箱24h，經(jīng)36mg／mL LSPM1和36mg／mL LSPM2分別作用后，定時收集細胞，PBS沖洗，加入100μL 細胞裂解液，置于4℃下10min，離心后吸取上清液，并加入2μL 濃度為20mg／mL 的RNase A，置于37℃下60min，再加入2μL 濃度為20mg／mL 的proteinase K，置于37℃下60min，然后加入NaCl-異丙醇，置于-20℃下，靜止過夜。然后離心（7，200g）15min后，去除NaCl-異丙醇，加入TE后沉淀溶解，經(jīng)過1%的瓊脂凝膠電泳（80V），1h后，紫外燈下檢測并攝像。

1.10 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件包進行處理。用獨立樣本方差分析各組間的差異，結(jié)果以均數(shù)±標準偏差（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 LSPM1和LSPM2對CAL-27細胞生長抑制率的影響

通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：1.875mg／mL、7.5mg／mL、15mg／mL、30mg／mL LSPM1對CAL-27細胞作用48h后，抑制率分別達到（45.40±9.51）%、（43.35±5.19）%、（65.63±5.45）%和（79.14±8.09）%，與空白對照組比較，具有顯著性差異，有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。1.875mg／mL、3.75 mg／mL、7.5mg／mL、15mg／mL和30mg／mL LSPM2對CAL-27細胞作用48h后，抑制率分別達到）21.94±2.68）%、（39.31±4.63）%、（47.81±14.24）%、（69.66±5.38）%和（85.29±2.95）%，與空白對照組比較，具有顯著性差異，有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。LSPM1和LSPM2對CAL-27細胞的作用無顯著性差異（見圖1）。以上結(jié)果表明：乳桿菌A-2代謝產(chǎn)物對CAL-27細胞生長抑制率具有濃度依賴性。

圖1 LSPM1和LSPM2對CAL-27細胞增殖的影響

2.2 熒光顯微鏡觀察CAL-27細胞凋亡的形態(tài)學改變

利用經(jīng)吖啶橙染色后在熒光顯微鏡下觀察，空白對照組中CAL-27細胞核為均一的綠色熒光，細胞貼壁良好；然而經(jīng)過36mg／mL LSPM1和36mg／mL LSPM2 處 理16h 后，CAL-27細胞染色質(zhì)濃縮成塊狀、邊緣化、核膜裂解、出現(xiàn)凋亡小體（見圖2）。

圖2 CAL-27細胞形態(tài)特征

2.3 LSPM1和LSPM2誘導CAL-27細胞凋亡的流式細胞儀分析

經(jīng)FCM 檢測發(fā)現(xiàn)，濃度為36mg／mL 的LSPM1作用于CAL-27 細胞12h 后，早期凋亡率和晚期凋亡率分別為37.20%和10.09%；濃度為36mg／mL 的LSPM2 作用于CAL-27 細胞12h 后，早期凋亡率和晚期凋亡率分別為11.22%和69.48%；而對照組的早期凋亡率和晚期凋亡率分別為2.23%和4.27%。可見，實驗組結(jié)果明顯高于對照組（見圖3）。

圖3 LSPM1和LSPM2對CAL-27細胞凋亡的影響

2.4 瓊脂糖凝膠電泳法分析細胞凋亡

瓊脂糖凝膠電泳顯示，36mg／mL LSPM1和36mg／mL LSPM2對CAL-27細胞作用不同的時間后，DNA 出現(xiàn)片段化，在250～750bp之間出現(xiàn)明顯的“階梯狀”DNA 條帶，說明DNA 在核小體連接處被切斷，CAL-27 細胞發(fā)生凋亡。由此證明了乳桿菌A-2代謝產(chǎn)物可誘導CAL-27細胞凋亡。

圖4 LSPM1和LSPM2誘導CAL-27細胞凋亡電泳圖

3 討論

益生菌是口腔微生物菌群的重要組成菌，益生菌（尤其是乳桿菌）可通過抑制致病菌生長和繁殖、與致病菌競爭口腔黏膜表面的黏附位點等，保護口腔健康，預防口腔軟硬組織疾病。肖越紅等［5］研究證明乳桿菌DM9811代謝產(chǎn)物脂肪酸組分對口腔白假絲酵母菌有明顯的抑殺作用；對口腔鏈球菌有促進作用，可能有調(diào)整口腔菌群平衡的作用。曲虹等［6］研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌DM9811（Lactobacillus DM9811）代謝產(chǎn)物可以改善固定正畸治療患者的改良菌斑指數(shù)（MPLI）和唾液pH，抑制變形鏈球菌（streptococcusmutans）生長和維持正畸治療患者的口腔內(nèi)菌群平衡。

肽聚糖（peptidoglycan，PG）是乳酸桿菌細胞壁的主要組成成分［7］。研究顯示肽聚糖成分在提高肌體免疫監(jiān)視功能方面可能起重要作用。溫曉慶等［8］以肝癌H22細胞移植瘤KM 小鼠為模型，研究干酪乳桿菌（Lactobacillus case）細胞壁肽聚糖的抗腫瘤作用，結(jié)果顯示，實驗組增殖細胞核抗原（PCNA）的m RNA 表達和BLC-2基因的蛋白表達平均光密度值均明顯低于對照組，且抑瘤率37.21%。

乳桿菌的代謝產(chǎn)物乳桿菌胞外多糖（exopoly-saccharides，EPS）具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功能。Choi等［9］研究證實嗜酸乳桿菌EPS具有抗癌活性且可誘導HT-29結(jié)腸癌細胞凋亡。張鈞等［10］研究表明乳桿菌EPS在體外有一定的促進對人大腸癌LS174T 細胞的凋亡的作用。翟碩莉［11］報道了乳酸菌胞外多糖抗腫瘤的作用機制之一是乳酸菌能夠誘導癌細胞凋亡。王江等［12］證明彎曲乳桿菌T79-3黏附能力最強，對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，排除作用方式抑制金黃色葡萄球菌黏附He La細胞作用效果較好，提示乳桿菌T79-3有可能作為益生菌防治婦女泌尿生殖道感染。

乳清蛋白主要用于治療糖尿病和高血壓，在抗腫瘤方面的研究較少［13，14］。乳清蛋白主要由β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin，BLG，58%）和α-乳白蛋白（α-Lactalbumin，ALA，13%）組成。β-乳球蛋白是硫氨基酸主要來源，具有免疫調(diào)節(jié)作用，α-乳白蛋白具有預防癌癥的功能［15］。而且，乳清蛋白中的生物活性肽和氨基酸可以通過蛋白酶降解或微生物發(fā)酵而釋放出來。本實驗中，通過乳桿菌A-2去降解乳清蛋白和乳清蛋白與菊糖組成的混合物，分別得到代謝產(chǎn)物LSPM1和LSPM2，已經(jīng)證實LSPM1和LSPM2中含有一些多肽、氨基酸、短鏈脂肪酸，乳酸、醋酸、丁酸等化學物質(zhì)。利用人舌鱗癌細胞系CAL-27 體外培養(yǎng)模型初步評價了LSPM1和LSPM2的抗癌活性，為益生菌代謝產(chǎn)物在治療口腔癌方面提供理論和實驗基礎(chǔ)。

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