棉花纖維長度近等基因系R01—40—08的背景遺傳效應分析

張霞等

摘要：從海島棉Pima S-6中鑒定了一個1號染色體上穩定表達的纖維長度QTL（qFL-chr1），針對這一目標QTL，通過標記輔助選擇得到近等基因系R01-40-08。近等性分析結果表明，該近等基因系其他7條染色體上仍含有 Pima S-6 的漸滲片段。以Tamcot 2111（輪回親本）與R01-40-08（供體親本）構建了1個含有1 672個單株的F2群體，分析了其他染色體上Pima S-6漸滲片段對纖維長度的遺傳效應，單標記分析結果表明，位于14號染色體上的2個標記（NAU2190 和NAU5465）對纖維長度有顯著的影響。

關鍵詞：纖維長度；漸滲系；近等基因系

中圖分類號： S562.032文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0085-03

收稿日期：2014-04-16

基金項目：國家自然科學基金（編號：31171595）；江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（12）5039]。

作者簡介：張霞（1988—），女，山東莒縣人，碩士研究生，主要從事棉花分子育種研究。Tel：（025）84390291；E-mail：zxia_1988@163.com。

通信作者：沈新蓮，博士，研究員，主要從事棉花分子育種研究。Tel：（025）84390291；E-mail：xlshen68@126.com。棉花是世界上重要的纖維作物，纖維品質是評價棉花品種的重要指標之一。纖維長度、纖維強度等重要品質指標與棉花產量及產量構成因素存在顯著的負相關關系[1-5]，這些因素制約了棉纖維品質的遺傳改良。分子標記技術的發展為研究纖維品質的遺傳和改良提供了一條新途徑，迄今為止，國內外學者利用不同的優質纖維材料篩選并鑒定了100多個與纖維長度相關的數量性狀位點[6]。目前，這些研究所用的群體都為F2、BC1和重組自交系群體，群體遺傳背景較復雜，存在如QTL間的互作與QTL與環境的互作，導致所估計的QTL的效應與位置的精確性有限。由這些群體獲得的QTL的分辨率通常在10～30 cM之間[7-8]。在這樣大的區間內，可能存在多個連鎖的QTL，無法分解緊密連鎖的負相關性狀QTL，影響標記輔助選擇的效率以及對分子機理的研究。

近年來，近等基因系被廣泛用于植物數量性狀QTL的精細定位研究中[9-11]，因為近等基因系只含有供體的1個至幾個漸滲片段，性狀的復雜性被降低到類似于由單基因控制的性狀，可以更精確地估計QTL的效應、研究QTL之間的互作及QTL與環境的互作，在目標QTL區域形成的重疊漸滲系可以促進數量性狀基因的精細作圖，降低連鎖累贅程度，最終完成QTL圖位克隆。除了目標染色體區域外，近等基因系通常含有一定數量的供體染色體片段，這些遺傳背景對目標QTL的效應具有影響，影響目標QTL的精細定位及遺傳效應估計。

在前期研究中，美國佐治亞大學通過回交高代QTL作圖方法，從海島棉Pima S-6中篩選、鑒定了1個1號染色體上的纖維長度QTL（qFL-chr1），該QTL解釋的表型變異較高（12%～24%），而且在多個群體中均能檢測到[12]。針對這一目標QTL，江蘇省農業科學院與美國佐治亞大學通過標記輔助選擇共同培育了近等基因系R01-40-08，該近等基因系在美國、中國南京的多年多點試驗中纖維長度均顯著高于輪回親本Tamcot 2111[13]。本研究以Tamcot 2111與R01-40-08為親本構建了1個F2群體，分析了其他染色體上Pima S-6漸滲位點對纖維長度的遺傳效應，以期構建高遺傳相似度的纖維長度單QTL近等基因系，為后期纖維長度QTL圖位克隆提供重要的材料基礎。

1材料與方法

1.1材料

江蘇省農業科學院與美國佐治亞大學通過標記輔助選擇共同培育了1個增效基因來源于海島棉Pima S-6的纖維長度QTL單片段漸滲系R01-40-08。

1.2群體構建

2008年，將R01-40-08種植在江蘇省農業科學院溧水植物試驗基地，以Tamcot 2111為母本與R01-40-08供體親本雜交獲F1；同年冬季將F1種植在海南試驗基地，自交得F2；2009年將F2群體（共1 672個單株）種植在江蘇省農業科學院溧水植物科學試驗基地，收獲重組個體單株籽棉，棉樣送交農業部纖維檢測實驗室檢測纖維品質。2010年重組個體家系種植在江蘇省農業科學院溧水植物科學試驗基地，重復2次，按家系收獲籽棉，棉樣送交農業部纖維檢測實驗室檢測纖維長度（FL）。纖維長度由HVI900纖維品質測試儀檢測。

1.3SSR分析

DNA采用改進的CTAB法提取[14]。引物參照Guo等發表的遺傳圖譜選擇[15-16]。SSR參照文獻[17]分析。

1.4單標記分析

根據分子標記結果將數據分組，利用方差相同的t測驗檢驗組間平均數的差異，確定標記與性狀的連鎖關系[18]。把性狀與標記的回歸方程中的決定系數作為標記能夠解釋性狀的效應[19]。

2結果與分析

2.1近等基因系R01-40-08的近等性分析

為了分析近等基因系R01-40-08與輪回親本的遺傳相似度，根據已發表的2個棉花遺傳連鎖圖譜[15-16]，選擇534個分布于棉花整個基因組的SSR引物分析漸滲系R01-40-08與供體親本Pima S-6和輪回親本Tamcot 2111之間的多態性。結果表明，供體親本Pima S-6和輪回親本Tamcot 2111呈現多態性的引物有413個，其中R01-40-08和輪回親本Tamcot 2111之間呈現多態性的引物23個。其中1號染色體11個（BNL2921、JESPR240、NAU422、MUSS84、MUSS422、CIR018、JESPR56、NAU2182、TMD03以及BNL3090和STS引物（STS38）1對、2號染色體1個（NAU2858）、3號染色體2個（NAU1167和NAU5445）、14號染色體3個（NAU2190、NAU3820、NAU5465）、15號染色體1個（NAU2573）、19號染色體3個（NAU3110、NAU1221、NAU1042）、20號染色體1個（NAU3407）、23號染色體1個（NAU3732）。遺傳背景相似性估計=N/S×100%，式中：N表示R01-40-08和輪回親本Tamcot 2111之間為單態的標記數，S表示供體親本Pima S-6和輪回親本Tamcot 2111之間呈現多態性的引物總數（390/413=94.43%），因此漸滲系含有輪回親本Tamcot 2111的94.43%基因組。

前期研究中在回交高代QTL分析中發現，除了1號染色體外，14、15、20、23號染色體上也存在纖維長度QTL[12]。基于RFLP和SSR的遺傳圖譜[20]和SSR標記的遺傳圖譜[15]中的橋梁標記，由此推斷14、15、23號染色體上的Pima S-6遺傳位點與纖維長度QTL連鎖較緊密，可能這些位點對纖維長度QTL依然存在遺傳效應。

2.2Pima S-6背景遺傳位點對纖維長度的影響

為了進一步證實Pima S-6遺傳背景對纖維長度的影響，本研究以Tamcot 2111為母本與R01-40-08供體親本構建了1個含有1 672個單株的F2群體。根據目標QTL區間分子標記基因型的篩選，共鑒定了432個重組個體，用上述12對位于非目標QTL區間上的引物對F2群體的重組個體進行基因型鑒定并進行單標記分析，根據基因型鑒定結果，對單標記帶型含有Pima S-6片段與不含有Pima S-6片段進行方差分析。對2009年F2群體背景標記對纖維長度單標記分析結果，遺傳背景中Pima S-6位點對纖維長度影響不顯著；對2010年F3群體單標記分析結果，14號染色體上的2個標記NAU2190 和NAU5465對纖維長度有顯著的影響（表1）。15、23號上的Pima S-6遺傳位點對纖維長度沒有影響，可能在回交的過程中Pima S-6遺傳位點與纖維長度QTL已發生重組，不存在連鎖關系。

表1Pima S-6遺傳背景單標記方差分析

標記染色體貢獻率（%）P值2009年2010年2009年2010年NAU1167Chr.33.65.40.870.20NAU3820Chr.142.21.90.630.48NAU5465Chr.1400.30.240.022NAU2190Chr.140. 21.80.110.005NAU1221Chr.196.83.50.890.22NAU3110Chr.191.43.70.160.31NAU3407Chr.201.900.640.16NAU3732Chr.231.70.10.630.81

3結論與討論

隨著QTL定位技術在各種作物中的廣泛應用，借助分子連鎖圖譜進行QTL分析以及對目標QTL構建近等基因系，通過構建NIL群體來進行QTL的精確定位，可以使復雜的數量性狀也能像孟德爾因子一樣進行分析，進而通過圖位克隆來獲得數量性狀位點基因，最大限度挖掘有利基因位。近等基因系可通過連續多次回交法[21]、從突變體中分離獲得[22]和雜交高世代群體中分離選育[23]等方法。利用分子標記輔助選擇結合連續回交選育法是獲得近等基因系最有效的手段。在回交過程中，除了目標性狀基因轉移外，盡快恢復輪回親本的基因組是構建近等基因系的關鍵。除了目標染色體區域外，近等基因系通常含有一定數量的供體染色體片段，這些遺傳背景對目標QTL效應產生影響，從而影響目標QTL的精細定位及遺傳效應的估計。

本研究中的近等基因系R01-40-08是通過回交高代QTL作圖方法并結合分子標記輔助選擇創造獲得的。Yamamoto等曾使用經典的高世代回交方法獲得近等基因系并精細定位和克隆了水稻抽穗期QTL[24-25]。盡管該方法獲得近等基因系耗時較長，但由于近等基因系與輪回親本背景高度相似，所以極適合微效QTL遺傳效應的估計。近等性分析表明，R01-40-08 已含有輪回親本94.43%的基因組，背景中仍含有少量Pima S-6漸滲位點。在對棉花1號染色體上纖維長度QTL精細定位的基礎上，繼續選擇在目標QTL區間含有較小漸滲片段的重組個體，與輪回親本回交，并結合前景與背景分子標記輔助選擇以及表型鑒定，可以獲得遺傳背景與輪回親本高度相似的單QTL近等基因系。這些纖維長度單QTL近等基因系的獲得為數量性狀位點圖位克隆和基于單個數量性狀位點下纖維發育的分子機制研究創造重要的材料。

參考文獻：

[1]潘家駒. 棉花育種學[M]. 北京：中國農業出版社，1998.

[2]Miller P A，Williams J C，Robinson H F，et al. Estimate of genotypic and environmental variances and covariances in upland cotton and their implication in selection[J]. Agronomy Journal，1958，50：126-131.

[3]Miller P A，Rawlings J O. Breakup of initial linkage blocks through intermating in a cotton breeding population[J]. Crop Science，1967，7：199-204.

[4]Meredith W R，Bridge R R. Break up of linkage blocks in cotton，Gossypium hirsutum L.[J]. Crop Science，1971，11：695-698.

[5]May O L. Genetic variation for fiber quality[M]//Basra A S. Cotton fibers-developmental biology，quality improvement，and textile processing. New York：Food Products Press，1999：183-229.

[6]Chee P W，Campbell B T. Bridging classical and molecular genetics of cotton fiber quality and development[J]. Plant Genetics and Genomics：Crops and Models，2009，3：283-311.

[7]Paterson A H，Saranga Y，Menz M，et al. QTL analysis of genotype×environment interactions affecting cotton fiber quality[J]. Theoretical and Applied Genetics，2003，106（3）：384-396.

[8]Shen X L，Guo W Z，Lu Q X，et al. Genetic mapping of quantitative trait loci for fiber quality and yield trait by RIL approach in upland cotton[J]. Euphytica，2007，155（3）：371-380.

[9]Xie X B，Song M H，Jin F X，et al. Fine mapping of a grain weight quantitative trait locus on rice chromosome 8 using near-isogenic lines derived from a cross between Oryza sativa and Oryza rufipogon[J]. Theoretical and Applied Genetics，2006，113（5）：885-894.

[10]Shan J X，Zhu M Z，Shi M，et al. Fine mapping and candidate gene analysis of spd6，responsible for small panicle and dwarfness in wild rice（Oryza rufipogon Griff.）[J]. Theoretical and Applied Gene-tics，2009，119（5）：827-836.

[11]Zhou L，Zeng Y W，Zheng W W，et al. Fine mapping a QTL qCTB7 for cold tolerance at the booting stage on rice chromosome 7 using a near-isogenic line[J]. Theoretical and Applied Genetics，2010，121（5）：895-905.

[12]Chee P，Draye X，Jiang C X，et al. Molecular dissection of interspecific variation between Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense（cotton）by a backcross-self approach：Ⅲ.Fiber length[J]. Theoretical and Applied Genetics，2005，111：772-781.

[13]Shen X L，Cao Z B，Singh R，et al. Efficacy of qFL-chr1，a quantitative trait locus for fiber length in cotton（Gossypium spp.）[J]. Crop Science，2011，51（5）：2005-2010.

[14]Paterson A H，Brubaker C L，Wendel J F. A rapid method for extraction of cotton（Gossypium spp.）genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1993，11：122-127.

[15]Guo W Z，Cai C P，Wang C B，et al. A microsatellite-based，gene-rich linkage map reveals genome structure，function and evolution in Gossipium[J]. Genetics，2007，176：527-541.

[16]Xiao J，Wu K，Fang D D，et al. New SSR markers for use in cotton（Gossypium spp.）improvement[J]. Journal of Cotton Science，2009，13：75-157.

[17]Zhang J，Wu Y T，Guo W Z，et al. Fast screening of SSR markers in cotton with PAGE/Silver staining[J]. Cotton Sci Sin，2000，12：267-269.

[18]王慧，喻德躍，吳巧娟，等. 大豆對斜紋夜蛾抗生性基因的微衛星標記（SSR）的研究[J]. 大豆科學，2004，23（2）：91-95.

[19]徐吉臣，鄒亮星. 利用相關性分析鑒定與水稻根部性狀表達相關的分子標記[J]. 遺傳學報，2002，29（3）：245-249.

[20]Rong J K，Abbey C，Bowers J E，et al. A 3347-locus genetic recombination map of sequence-tagged sites reveals features of genome organization，transmission and evolution of cotton （Gossypium）[J]. Genetics，2004，166（1）：389-417.

[21]劉立峰，張洪亮，穆平，等. 水、旱稻根基粗、千粒重主效QTL近等基因系的構建及鑒評[J]. 農業生物技術學報，2007，15（3）：469-476.

[22]章清杞，黃榮華，張書標，等. 長穗頸不育系協青早eA（1）的選育[J]. 福建農業大學學報，2000，29（4）：411-415.

[23]Muehlbauer G J，Specht J E，Thomas-Compton M A，et al. Near-isogenic lines-a potential resource in the integration of conventional and linkage maps[J]. Crop Science，1988，28（2）：729-735.

[24]Yamamoto T，Kuboki Y，Lin S Y，et al. Fine mapping of quantitative trait loci Hd-1，Hd-2 and Hd-3，controlling heading date of rice，as single Mendelian factors[J]. Theoretische und Angewandte Genetik，1998，97（1/2）：37-44.

[25]Takahashi Y，Shomura A，Sasaki T，et al. Hd6，a rice quantitative trait locus involved in photoperiod sensitivity，encodes the alpha subunit of protein kinase CK2[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（14）：7922-7927.

[7]Paterson A H，Saranga Y，Menz M，et al. QTL analysis of genotype×environment interactions affecting cotton fiber quality[J]. Theoretical and Applied Genetics，2003，106（3）：384-396.

[8]Shen X L，Guo W Z，Lu Q X，et al. Genetic mapping of quantitative trait loci for fiber quality and yield trait by RIL approach in upland cotton[J]. Euphytica，2007，155（3）：371-380.

[9]Xie X B，Song M H，Jin F X，et al. Fine mapping of a grain weight quantitative trait locus on rice chromosome 8 using near-isogenic lines derived from a cross between Oryza sativa and Oryza rufipogon[J]. Theoretical and Applied Genetics，2006，113（5）：885-894.

[10]Shan J X，Zhu M Z，Shi M，et al. Fine mapping and candidate gene analysis of spd6，responsible for small panicle and dwarfness in wild rice（Oryza rufipogon Griff.）[J]. Theoretical and Applied Gene-tics，2009，119（5）：827-836.

[11]Zhou L，Zeng Y W，Zheng W W，et al. Fine mapping a QTL qCTB7 for cold tolerance at the booting stage on rice chromosome 7 using a near-isogenic line[J]. Theoretical and Applied Genetics，2010，121（5）：895-905.

[12]Chee P，Draye X，Jiang C X，et al. Molecular dissection of interspecific variation between Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense（cotton）by a backcross-self approach：Ⅲ.Fiber length[J]. Theoretical and Applied Genetics，2005，111：772-781.

[13]Shen X L，Cao Z B，Singh R，et al. Efficacy of qFL-chr1，a quantitative trait locus for fiber length in cotton（Gossypium spp.）[J]. Crop Science，2011，51（5）：2005-2010.

[14]Paterson A H，Brubaker C L，Wendel J F. A rapid method for extraction of cotton（Gossypium spp.）genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1993，11：122-127.

[15]Guo W Z，Cai C P，Wang C B，et al. A microsatellite-based，gene-rich linkage map reveals genome structure，function and evolution in Gossipium[J]. Genetics，2007，176：527-541.

[16]Xiao J，Wu K，Fang D D，et al. New SSR markers for use in cotton（Gossypium spp.）improvement[J]. Journal of Cotton Science，2009，13：75-157.

[17]Zhang J，Wu Y T，Guo W Z，et al. Fast screening of SSR markers in cotton with PAGE/Silver staining[J]. Cotton Sci Sin，2000，12：267-269.

[18]王慧，喻德躍，吳巧娟，等. 大豆對斜紋夜蛾抗生性基因的微衛星標記（SSR）的研究[J]. 大豆科學，2004，23（2）：91-95.

[19]徐吉臣，鄒亮星. 利用相關性分析鑒定與水稻根部性狀表達相關的分子標記[J]. 遺傳學報，2002，29（3）：245-249.

[20]Rong J K，Abbey C，Bowers J E，et al. A 3347-locus genetic recombination map of sequence-tagged sites reveals features of genome organization，transmission and evolution of cotton （Gossypium）[J]. Genetics，2004，166（1）：389-417.

[21]劉立峰，張洪亮，穆平，等. 水、旱稻根基粗、千粒重主效QTL近等基因系的構建及鑒評[J]. 農業生物技術學報，2007，15（3）：469-476.

[22]章清杞，黃榮華，張書標，等. 長穗頸不育系協青早eA（1）的選育[J]. 福建農業大學學報，2000，29（4）：411-415.

[23]Muehlbauer G J，Specht J E，Thomas-Compton M A，et al. Near-isogenic lines-a potential resource in the integration of conventional and linkage maps[J]. Crop Science，1988，28（2）：729-735.

[24]Yamamoto T，Kuboki Y，Lin S Y，et al. Fine mapping of quantitative trait loci Hd-1，Hd-2 and Hd-3，controlling heading date of rice，as single Mendelian factors[J]. Theoretische und Angewandte Genetik，1998，97（1/2）：37-44.

[25]Takahashi Y，Shomura A，Sasaki T，et al. Hd6，a rice quantitative trait locus involved in photoperiod sensitivity，encodes the alpha subunit of protein kinase CK2[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（14）：7922-7927.

[7]Paterson A H，Saranga Y，Menz M，et al. QTL analysis of genotype×environment interactions affecting cotton fiber quality[J]. Theoretical and Applied Genetics，2003，106（3）：384-396.

[8]Shen X L，Guo W Z，Lu Q X，et al. Genetic mapping of quantitative trait loci for fiber quality and yield trait by RIL approach in upland cotton[J]. Euphytica，2007，155（3）：371-380.

[9]Xie X B，Song M H，Jin F X，et al. Fine mapping of a grain weight quantitative trait locus on rice chromosome 8 using near-isogenic lines derived from a cross between Oryza sativa and Oryza rufipogon[J]. Theoretical and Applied Genetics，2006，113（5）：885-894.

[10]Shan J X，Zhu M Z，Shi M，et al. Fine mapping and candidate gene analysis of spd6，responsible for small panicle and dwarfness in wild rice（Oryza rufipogon Griff.）[J]. Theoretical and Applied Gene-tics，2009，119（5）：827-836.

[11]Zhou L，Zeng Y W，Zheng W W，et al. Fine mapping a QTL qCTB7 for cold tolerance at the booting stage on rice chromosome 7 using a near-isogenic line[J]. Theoretical and Applied Genetics，2010，121（5）：895-905.

[12]Chee P，Draye X，Jiang C X，et al. Molecular dissection of interspecific variation between Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense（cotton）by a backcross-self approach：Ⅲ.Fiber length[J]. Theoretical and Applied Genetics，2005，111：772-781.

[13]Shen X L，Cao Z B，Singh R，et al. Efficacy of qFL-chr1，a quantitative trait locus for fiber length in cotton（Gossypium spp.）[J]. Crop Science，2011，51（5）：2005-2010.

[14]Paterson A H，Brubaker C L，Wendel J F. A rapid method for extraction of cotton（Gossypium spp.）genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1993，11：122-127.

[15]Guo W Z，Cai C P，Wang C B，et al. A microsatellite-based，gene-rich linkage map reveals genome structure，function and evolution in Gossipium[J]. Genetics，2007，176：527-541.

[16]Xiao J，Wu K，Fang D D，et al. New SSR markers for use in cotton（Gossypium spp.）improvement[J]. Journal of Cotton Science，2009，13：75-157.

[17]Zhang J，Wu Y T，Guo W Z，et al. Fast screening of SSR markers in cotton with PAGE/Silver staining[J]. Cotton Sci Sin，2000，12：267-269.

[18]王慧，喻德躍，吳巧娟，等. 大豆對斜紋夜蛾抗生性基因的微衛星標記（SSR）的研究[J]. 大豆科學，2004，23（2）：91-95.

[19]徐吉臣，鄒亮星. 利用相關性分析鑒定與水稻根部性狀表達相關的分子標記[J]. 遺傳學報，2002，29（3）：245-249.

[20]Rong J K，Abbey C，Bowers J E，et al. A 3347-locus genetic recombination map of sequence-tagged sites reveals features of genome organization，transmission and evolution of cotton （Gossypium）[J]. Genetics，2004，166（1）：389-417.

[21]劉立峰，張洪亮，穆平，等. 水、旱稻根基粗、千粒重主效QTL近等基因系的構建及鑒評[J]. 農業生物技術學報，2007，15（3）：469-476.

[22]章清杞，黃榮華，張書標，等. 長穗頸不育系協青早eA（1）的選育[J]. 福建農業大學學報，2000，29（4）：411-415.

[23]Muehlbauer G J，Specht J E，Thomas-Compton M A，et al. Near-isogenic lines-a potential resource in the integration of conventional and linkage maps[J]. Crop Science，1988，28（2）：729-735.

[24]Yamamoto T，Kuboki Y，Lin S Y，et al. Fine mapping of quantitative trait loci Hd-1，Hd-2 and Hd-3，controlling heading date of rice，as single Mendelian factors[J]. Theoretische und Angewandte Genetik，1998，97（1/2）：37-44.

[25]Takahashi Y，Shomura A，Sasaki T，et al. Hd6，a rice quantitative trait locus involved in photoperiod sensitivity，encodes the alpha subunit of protein kinase CK2[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（14）：7922-7927.