基于第二代測序的大鱗副泥鰍生長相關SNP標記的開發

葛辰等

摘要：大鱗副泥鰍是鰍科重要經濟魚類，通過Illumina HiSeq 2000測序平臺對2個大鱗副泥鰍樣本的轉錄本進行了高通量測序，其中AB2011M-1是群體中生長較快的10尾魚的混合轉錄本，AB2011M-2是生長較慢的10尾魚的混合轉錄本。通過對以上2個混合轉錄本的測序，分別獲得了65 536和80 786個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）突變；對2個測序樣本進行表達差異的比較，獲得了39個表達差異基因。隨機選取120個位點設計引物，進行驗證分析，共獲得16個有效的多態性標記。

關鍵詞：大鱗副泥鰍；高通量測序；SNP；多態性標記；引物設計

中圖分類號： S917.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0021-07

主要從事魚類遺傳育種與保護生物學研究。E-mail：lingqf@suda.edu.cn。大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）屬鯉形目鰍科花鰍亞科副泥鰍屬，別稱板鰍、黃板鰍，是一種底棲雜食性淡水魚類，主要分布于東亞地區。大鱗副泥鰍的肉質鮮美、營養豐富[1]，近幾年來，其市場需求量不斷增大，已成為我國重要的水產養殖物種[2]。

育種是應用各種遺傳學方法，改造生物的遺傳結構，實現培育出高產優質品種的目標[3]。通過傳統育種方法獲得一個新品種需要經過5代以上人工選擇[4]，因此，利用傳統的育種方法獲得優良品系需要投入大量的時間、人工和資源；且育種操作多憑經驗來控制選擇手段，影響因素較多，不能快速滿足當前漁業發展對水產良種的需要。

隨著分子生物學的發展，分子標記輔助育種（molecular assisted selection，MAS）技術已日趨成熟。最早應用于MAS育種的分子標記有限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機擴增多態 DNA （random amplified polymorphic DNA，RAPD）[5]、擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）[6]等標記方法。近年來，簡單重復序列（Simple Sequence Repeat，SSR）和單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）也被應用于MAS育種[6-7]。其中，SNP作為新興的分子標記，擁有數目多、分布廣、遺傳穩定等優點而廣泛受到關注。

篩選未知或已知SNP的方法有等位基因特異寡核苷酸片段分析（allele-specific oligonucleotide，ASO）[8]、基因芯片技術（gene chips）[9]、探針技術（TaqMan）[10]、AFLP[11]、變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）、單鏈構想多態性（single strand conformation polymorphism，SSCP）[12]、直接測序等方法。這些方法各有所長，在不同的分析領域得到了廣泛的應用。其中，最快捷、開發量最大的是高通量測序方法，該方法通過不同個體的同一DNA片段的直接測序以及序列比對，使SNP突變的檢出率可達100%，且可以直接得到突變堿基的類型及其準確位置等 SNPs 分型的參數[13-14]。

在水產動物中，鯉[15]、草魚[16]、大口黑鱸[17]、櫛孔扇貝[18]等均已有SNP的研究報道，但迄今為止，尚未見到通過高通量測序批量開發大鱗副泥鰍SNP的研究報道。本研究旨在開發與生長差異相關的多態性SNP標記，為大鱗副泥鰍的分子育種奠定理論基礎和實踐方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

2011年，以400組洪澤湖野生大鱗副泥鰍為親本，進行人工繁殖，獲得1個混合選育群體。2012年10月，隨機采樣200尾子代，測量體寬、體長、全長、周長、體厚和體重等性狀指標，然后選取生長顯著快速的10尾魚[體質量（11.02±103） g]和顯著緩慢的10尾魚[體質量（2.25±0.36） g]，分別標志為混合樣本AB2011M-1和AB2011M-2。分別提取以上2組試驗魚的肌肉組織，于RNA樣本保存液 （D311A，TaKaRa） 中4 ℃保存備用。

1.2RNA的提取與轉錄組文庫構建

用TRIzol 試劑對樣本肌肉組織提取總RNA，等量混合成快、慢2個轉錄組測序樣本。對cDNA庫進行片段長度的篩選，進行PCR擴增（使用Phusion DNA聚合酶，共15個循環），擴增產物由2%瓊脂糖電泳檢測，回收300～500 bp的cDNA片段。

1.3轉錄組測序與組裝

通過TBS-380微型熒光計的定量化測定，具有雙末端的cDNA片段在Illumina HiSeq 2000 （讀長長度為2×100 bp）平臺上進行測序。

使用SeqPre（https：//github.com/jstjohn/SeqPrep） 和condetri_v2.0.pl （http：//code.google.com/p/condetri/downloads/detail？name=condetri_v2.0.pl ）軟件進行序列除雜。用Trinity軟件對去雜后片段進行序列組裝和拼接（http：//trinityrnaseq.sourceforge.net/）。

1.4轉錄本基因注釋

使用蛋白質非冗余數據庫（NR數據庫）中的的BlastX程序進行轉錄本的比對，E值的設定為小于1.0×10-5[19]。比對獲得的序列使用Blast 2 GO軟件進行GO（gene ontology）注釋[20]，GO分類使用in-house perl scripts[21]；然后使用軟件blastx/blastp 2.2.24+對序列進行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析。

1.5SNP分析

將拼接好的序列作為對比模板，通過軟件Samtools （http：//samtools.sourceforge.net/）和VarScan v.2.2.7（http：//varscan.sourceforge.net/）將從AB2011M-1和AB2011M-2中獲得的序列信息分別與模板進行對比，得到候選SNP的信息。根據分析結果，選取差異基因所含的SNP，設計引物進行驗證。用Primer 5.0軟件設計引物，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。PCR擴增的反應體系為 20 μL，包含1 μL DNA模板，10 μL 2× PCR Mix（CW2296，世紀康為），上下游引物各1 μL，7μL H2O。PCR反應循環流程為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，25個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物首先通過2%瓊脂糖電泳進行初步篩選，具有清晰條帶的標記再通過6%聚丙烯凝膠電泳進行基因分型。在進行聚丙烯凝膠電泳前，用SSCP變性劑對產物進行95 ℃變性10 min，并立即冰浴處理。SSCP變性劑配方包括49 mL去離子甲酰胺、1 mL 0.5 mol/L EDTA（pH值8.0）、0.1 g溴酚藍、0.1 g二甲苯青FF。DNA分子質量標記采用Takara公司的DL-1 000 DNA marker。

2結果與分析

2.1數據的篩選、拼接與注釋

3討論與結論

3.1測序結果注釋

在本研究中，58.56%的序列預測到ORFs，60.98%的序列在NR數據庫中得到注釋，注釋到的基因參與了大鱗副泥鰍的代謝和其他生物過程，沒有被注釋到的基因可能是此物種的特異基因，需要通過進一步的研究將這些特異基因擴充至各個數據庫中，以豐富數據庫的內容。

3.2SNP的開發

本研究通過第二代測序技術在2個樣本中分別獲得 65 536 和80 786個SNP。由于是對轉錄本進行測序，因此，這些SNP又稱為cSNP。cSNP在轉錄區域形成的頻率遠低于非轉錄區[22]，在生物進化中這是為了保護物種的穩定性，轉錄區發生的非同義SNP突變可能會在進化過程中被淘汰，達到保護的目的[23]。cSNP與相關性狀有重要的聯系，因此，cSNP 往往具有重要的研究價值，可以為進一步的相關性狀關聯、代謝通路、遺傳作圖研究提供有效的工具，為分子育種奠定基礎。

SNP突變形式有轉換（C/T，G/A）和顛換（C/A，G/T，C/G，A/T），研究表明轉換出現的頻率約為顛換頻率的2倍[24]。本研究中，轉換/顛換為1.39，和Manuel等人對比目魚 EST-SNP 研究結果相近（1.408）[25]，與鮭魚[26]、烏頰魚[27]和斑馬魚[28]的EST-SNP研究結果（1.885）有一定差距，表明了不同生物在進化過程中承受著不同的進化壓力[22]。

3.3SNP的驗證

SNP是單個堿基引起的突變，在檢測中可能會造成假陽性，影響試驗的準確性[25-26]，因此，采取32個個體重復2次SSCP檢測，以消除假陽性干擾。本研究SNP驗證率（239%）較預期（50%）低，可能是由于使用的擴增模板是DNA，其中的內含子會同時被擴增出來。內含子也可能存在SNP的干擾，造成擴增片段長度過大、擴增條帶多而雜，降低了在聚丙烯凝膠電泳中的分辨率[29]，由此造成某些具有多態的SNP無法被鑒定。

參考文獻：

[1]Cho Y S，Kim B S，Kim D S，et al. Modulation of warm-temperature-acclimation-associated 65-kDa protein genes （Wap65-1 and Wap65-2） in mud loach （Misgurnus mizolepis，Cypriniformes） liver in response to different stimulatory treatments[J]. Fish & Shellfish Immunology，2012，32（5）：662-669.

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