豬瘟活疫苗（傳代細胞源）免疫豬的攻毒保護試驗

張毓金，林旭埜，吳文福，任向陽，游啟有，岑小清，張木輝，馮忠武，馮忠澤，寧宜寶

（1.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東 廣州 511356；2.中國獸醫藥品監察所，北京 海淀 100081）

豬瘟是豬的一種高度接觸性病毒性傳染病,對我國養豬業造成的損失很大，我國將其列為一類動物傳染病。目前，疫苗免疫接種仍是預防控制豬瘟的最有效的手段。我國在1954年成功培育了豬瘟兔化弱毒株，由此制備的豬瘟兔化弱毒組織苗在我國的豬瘟防控工作中發揮了重要的作用[1-2]。但由于組織苗有著生產工藝不穩定、病毒滴度不高、成本較高等諸多問題，近年來我國研制出采用傳代細胞系生產的豬瘟活疫苗，不僅生產工藝穩定，還能夠有效解決疫苗中BVDV外源病毒污染的問題，保證了疫苗的質量[3]。

近年來，我國成功研制的豬瘟活疫苗（傳代細胞源）在實驗室取得大量可靠數據，在此研究基礎上，本試驗將其在豬場進行臨床應用試驗，通過對田間免疫豬進行豬瘟強毒攻擊，并采用阻斷ELISA方法對試驗血清樣本進行豬瘟抗體檢測，以評估該疫苗在豬場實際使用的免疫保護效果。

1 材料

1.1 試驗用疫苗 豬瘟活疫苗（傳代細胞源）5批，均由廣東永順生物制藥股份有限公司生產，經檢驗全部合格。批號分別為ST0801、ST0802、ST0803、ST0804、ST0805，病毒含量8500RID/頭份。

1.2 試驗豬 來源于廣東韶關某豬場（簡稱韶關場）、廣東廣州某豬場（簡稱廣州場）兩個種、肉豬配套場。

1.3 攻毒用強毒 豬瘟石門系血毒，由廣東永順生物制藥股份有限公司制備、鑒定、保存。

1.4 豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒 購自IDEXX公司。

1.5 豬瘟病毒RT-PCR檢測試劑盒 購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司。

2 方法

2.1 分組 取ST0801、ST0802兩批疫苗，每批疫苗在廣州場各免疫仔豬500頭，分別標記為A、B組；取ST0803、ST0804、ST0805三批疫苗，每批疫苗在韶關場各免疫仔豬400頭左右，分別標記為C、D、E組；從每場隨機選取條件相同的仔豬各10頭不免疫疫苗，作為非免疫對照豬，運回廣東永順生物制藥股份有限公司健康豬舍飼養。

2.2 免疫程序與方法 采用20日齡首免，60日齡進行二免，每頭豬耳后頸部肌肉注射豬瘟活疫苗（傳代細胞源）1頭份，免疫仔豬在原豬場按正常方法飼養。

2.3 免疫豬的免疫監測 首免前對供試仔豬抽血并分離血清，用ELISA方法檢測豬瘟抗體（CSFAb）；二免后28 d(攻毒前)、90 d(攻毒前)分別抽血并分離血清，用ELISA方法檢測相應時期的豬瘟抗體（CSF-Ab）。

2.4 強毒攻擊 從兩個豬場分別于二免后28 d、90 d各抽取不同批次疫苗免疫的豬5頭，同時選取相同豬場相同日齡的非免疫對照豬各5頭，在廣東永順生物制藥股份有限公司負壓控制動物舍進行強毒攻擊，每頭豬注射豬瘟石門系強毒血毒1.0mL（105.0MLD）。

2.5 免疫效果評價 攻毒后每天觀察臨床癥狀，每天上、下午各測體溫1次，連續觀察16 d，將攻毒死亡豬抽取心血并分離血清，用RT-PCR方法檢測豬瘟抗原（CSF-Ag）、用ELISA方法檢測豬瘟抗體（CSF-Ab）；對存活豬于攻毒后16 d分別抽血并分離血清，用RT-PCR方法檢測豬瘟抗原（CSF-Ag）、用ELISA方法檢測豬瘟抗體（CSF-Ab）。

2.6 抗體檢測方法

2.6.1 操作方法 按試劑盒的使用說明書進行。

2.6.2 判定標準 豬瘟抗體檢測試驗（阻斷ELI?SA）成立條件：陰性對照的平均OD450值應大于0.50，陽性對照的阻斷率應大于50%，試驗方成立有效。樣品阻斷率=（陰性對照平均OD450值-樣品OD450值）/陰性對照平均OD450值 ×100%。被檢樣品的阻斷率不小于40%，該樣品為豬瘟抗體陽性；樣品阻斷率不大于30%，該樣品為陰性；樣品阻斷率在30%～40%之間，該樣品為可疑。

3 結果

3.1 免疫豬的豬瘟血清抗體合格率檢測結果 廣州場A、B兩組20日齡仔豬（免疫前）的豬瘟母源抗體陽性率為70%（7/10），二免后28 d（攻毒前），豬瘟血清抗體合格率為80%（8/10），攻毒后觀察16 d（試驗結束）的豬瘟血清抗體合格率為90%（9/10）；二免后90 d（攻毒前）的豬瘟血清抗體合格率為90%（9/10），攻毒后觀察16 d（試驗結束）的豬瘟血清抗體合格率為90%（9/10）。韶關場C、D、E三組20日齡仔豬（免疫前）的母源抗體陽性率為67%（10/15），二免后28 d（攻毒前）的豬瘟血清抗體合格率為87%（13/15），攻毒后觀察16 d（試驗結束）的豬瘟血清抗體合格率為93%（14/15）；二免后90 d（攻毒前）的豬瘟血清抗體合格率為93%（14/15），攻毒后觀察16 d（試驗結束）的豬瘟血清抗體合格率為93%（14/15）。結果見表1～2。

3.2 免疫豬的檢測結果

3.2.1 用RT-PCR方法檢測CSF-Ag結果 試驗組免疫豬攻毒前后與非免疫對照豬攻毒前采集血清，用RT-PCR方法檢測豬瘟病毒抗原，結果均為陰性，而對照組攻毒死亡豬的血清中CSF-Ag檢測結果均為100%陽性。結果見表3。

3.2.2 試驗豬臨床觀察結果 用豬瘟活疫苗（傳代細胞源）兩次免疫后的第28天和第90天，對試驗組與非免疫對照豬同時進行強毒攻擊保護試驗，攻毒后每天測豬體溫2次，同時觀察臨床癥狀，連續觀察16 d。結果表明，免疫豬體溫、食欲均正常，精神狀況良好，所有豬健活，而非免疫對照豬全部發病死亡。結果見表1～2。

如表1、表3所示，在豬場臨床應用條件下，按20日齡首免，60日齡二免的程序進行免疫，每頭豬接種豬瘟活疫苗（傳代細胞源）1頭份，廣州場二免后28 d的血清豬瘟抗體合格率為80%，韶關場二免后28 d的血清豬瘟抗體合格率為87%，二免后28 d免疫豬體內檢測不到豬瘟病毒抗原；免后28 d后，免疫豬能有效抵抗豬瘟強毒攻擊，免疫豬既無體溫升高，也無豬瘟臨床癥狀，全部健活，攻毒16 d所有豬體內均檢測不到豬瘟病毒抗原，而兩個豬場的非免疫對照組100%（10/10）死亡，10頭對照豬血清中豬瘟病毒抗原檢測均為陽性。

表1 豬瘟活疫苗（傳代細胞源）二免后28 d攻毒試驗抗體

表2 豬瘟活疫苗（傳代細胞源）二免后90 d攻毒試驗

表3 血清中豬瘟抗原陽性率檢測

如表2、表3所示，在豬場臨床應用條件下，按20日齡首免，60日齡二免的程序進行免疫，每頭豬接種豬瘟活疫苗（傳代細胞源）1頭份，廣州場二免后90 d的血清豬瘟抗體合格率為90%，韶關場二免后90 d豬瘟血清抗體合格率為93%。二免后90 d免疫豬體內均檢測不到豬瘟病毒抗原，用豬瘟強毒攻毒后既無體溫升高，也無臨床癥狀，全部健活，攻毒后16 d所有豬體內均檢測不到豬瘟病毒抗原，而兩個豬場的非免疫對照組100%（10/10）發病死亡，死亡豬血清中豬瘟病毒抗原檢測均為陽性。

4 討論與結論

4.1 豬瘟傳代細胞苗免疫效果 豬瘟兔化弱毒疫苗的廣泛應用對我國豬瘟疾病的有效防控有著重要的作用[4]。已有研究表明，應用該疫苗免疫接種的豬，可以抵抗不同豬瘟病毒基因亞群野毒的攻擊，提供很好的免疫保護效果[4-5]。采用豬傳代細胞系（ST細胞系）生產的豬瘟疫苗與傳統方法利用牛睪丸細胞（原代細胞）制備的豬瘟病毒疫苗相比，生產工藝更加穩定，批間差異減小，同時更好的控制BVDV污染問題[1]。試驗結果表明，豬瘟活疫苗（傳代細胞源）免疫豬均能有效抵抗豬瘟強毒的攻擊，既無死亡，也無豬瘟臨床癥狀；免疫豬能產生很好的免疫保護力，豬瘟抗體合格率均為80%以上。

4.2 制定合理的免疫程序 實施有效防疫的重要環節就是制定一個科學合理的免疫程序。合理的免疫程序是有效疫苗產生良好免疫效果的重要條件，其中包括接種次數、首免年齡、接種時間間隔等內容[6-8]。

豬瘟活疫苗（傳代細胞源）在實驗室條件下免疫接種一次，免疫豬即可獲得一年以上的免疫保護（另報），然而，在豬場實際使用會遇到如豬瘟母源抗體干擾、其他病原混合感染等諸多問題，因此在生產實際中建議進行兩次免疫。

在實際使用中，考慮到盡量避開高水平母源抗體對豬瘟活疫苗產生免疫效力的干擾作用，經過大量的研究證明，豬瘟母源中和抗體水平在30日齡到35日齡時開始出現下降拐點（另報），因而，我們通常推薦的豬瘟免疫程序是30日齡首免，本試驗采用20日齡首免，就是想了解較高的母源抗體對疫苗免疫的影響。

本試驗結果證明，在豬場臨床應用條件下，按照20日齡首免，60日齡進行二免的方法，豬瘟活疫苗（傳代細胞源）能突破較高水平母源抗體的干擾，疫苗能對免疫仔豬提供很好的免疫保護力。

4.3 選擇科學的檢測方法 測定豬場實際使用情況下豬瘟活疫苗的免疫效力對推廣使用豬瘟疫苗具有重要意義。目前，用于豬瘟疫苗免疫效果評估的方法有很多，選擇一個科學合理的檢測方法是科學評估的首要問題。在農業部制定的《2010年國家動物疫病強制免疫計劃》中，將經豬瘟抗體阻斷ELISA方法檢測陽性抗體判定為合格[9]。ELI?SA試驗具有快速、敏感、重復性好、樣品用量少、結果容易判斷等優點，是當前生產實際中最常用的豬瘟免疫效果檢測評估方法題[10-11]。

[1] 寧宜寶，吳文福.我國豬瘟流行新特點與疫苗免疫研究[J].中國獸藥雜志，2011，45(8)：33-37.

[2] 張平，孫惠玲，孫繼國.5種商品化豬瘟疫苗免疫豬后的抗體水平監測比較[J].動物醫學進展，2010，31(10)：113-115.

[3] 孫彥偉，查云峰，田云，等.三個廠家豬瘟活疫苗免疫效果比較試驗[J].廣東畜牧獸醫科技，2012，37(2)：29-32.

[4] 丁壯.豬瘟及其防制[M].北京：金盾出版社，2005：1-8.

[5] Freitas T R，Caldas L A，Rebello M A.Protaglandin A1 inhibits replication of classical swine fever Virus[J].Mem Inst Oswaldo Cruz，1998，93(6)：815-818.

[6] 何志強，何雪紅，王鑫，等.影響豬瘟免疫效果的因素及防治措施[J].畜牧與飼料科學，2010，31(1)：188-189.

[7] 曾存芳.不同方法和試劑檢測豬瘟免疫抗體結果對比試驗[J].畜禽業，2009（9）：23.

[8] 董永森.豬瘟免疫監測調查與分析[J].上海畜牧獸醫通訊，2009(5）：23-24.

[9] 覃紹敏，謝彬，馬玲，等.某規模化豬場豬瘟抗體水平及其野毒感染的檢測與分析[J].獸醫科技，2011（9）：92-94.

[10] 王治方，郭成留，張清華，等.兩種不同方法對豬瘟免疫效果評估對比試驗[J].中國畜牧獸醫 2007，34（9）：99-100.

[11] 黃劍鋒.兩種不同方法對豬瘟免疫效果評估對比試驗[J].福建畜牧獸醫，2013，35(2)：22-23.