七氟醚對神經發(fā)育期大鼠遠期認知功能影響及機制探討

何家璇，孟麗華，袁浩崢，張勇，吳剛

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710004)

人類神經元系統(tǒng)在懷孕中期(孕18周)至出生后2年都是快速發(fā)育的時期，這段時間若受到外界因素影響，易致中樞神經系統(tǒng)受損。基礎研究多選取大鼠為研究對象，由于屬間差異，大鼠在出生25 d內其神經系統(tǒng)快速發(fā)育，此時期為大鼠的神經發(fā)育期，在此期間，大鼠海馬突觸生長高度活躍[1]。七氟醚是目前臨床上常用的吸入麻醉藥，具有無色、氣味芳香、起效快速且作用時間短等優(yōu)點，臨床上廣泛應用于小兒麻醉誘導或麻醉維持[2]。我國每年均有較多小兒手術或各種檢查需行全身麻醉，但七氟醚對小兒遠期認知功能是否產生影響及其作用機制仍不清楚[3]。因此，本文選擇10日齡SD大鼠作為研究對象，探討七氟醚對神經發(fā)育期大鼠遠期認知功能損傷的機制，為臨床小兒安全麻醉用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

選擇清潔級SD雄性大鼠96只，7日齡，體重(14.1±2.9)g，來自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心，實驗動物取回后適應性喂養(yǎng)3 d后進行實驗。實驗遵循美國《實驗動物管理和使用指南》。

1.2 試劑及儀器

七氟醚購自日本丸石制藥株式會社，S/5多功能麻醉氣體監(jiān)測儀購自美國Datex-Ohmeda公司，MT-200 Morris水迷宮跟蹤系統(tǒng)購自中國成都泰盟科技有限公司，BDFF抗體購自英國Santa公司，PSD-95抗體購自英國Bioss公司；突觸蛋白-1購自英國Abcam公司，熒光二抗購自美國LICOR公司。

1.3 方法

將96只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為3組，每組32只。將其置于麻醉誘導箱中，空白組吸入空氣，兩七氟醚組通過調節(jié)七氟醚揮發(fā)罐及S/5多功能麻醉氣體監(jiān)測儀，七氟醚1組吸入2.8%七氟醚2 h，七氟醚2組吸入2.8%七氟醚4 h，氧流量為2 L/min，氧濃度為30%，以上3組處理均持續(xù)3 d，每組第2、3天處理保持與第1天相同時間段及相同的實驗環(huán)境條件。七氟醚兩組麻醉中觀察大鼠有無口唇、指趾發(fā)紺及呼吸抑制等情況。

認知功能檢驗：空白組及七氟醚兩組麻醉誘導30 d后，日齡40 d時，用MT-200Morris水迷宮綜合跟蹤系統(tǒng)行認知功能檢驗。劃分水迷宮水池為4個象限，每個象限設置入水點標記，在第4象限放置隱蔽圓形平臺，實驗共6 d，包括5 d訓練期及1 d探索期。訓練期每天訓練4次，從4個象限標記的入水點下水，期間記錄各組大鼠尋找平臺的時間(逃避潛伏期)；大鼠下水2 min找不到平臺時，引導大鼠尋找隱蔽平臺，找到后停留15 s，探索期撤去隱蔽平臺，任意選擇一點將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠2 min內穿越原隱蔽平臺次數(shù)及在第4象限(即平臺所在象限)滯留的時間。

BDNF、PSD95、突觸蛋白-1水平檢驗：實驗結束后，將空白組、七氟醚兩組大鼠斷頭處死，取海馬組織，用裂解液提取蛋白并測定蛋白濃度。用聚丙烯酞胺凝膠電泳對目的蛋白進行分離，冰浴轉膜，用脫脂奶粉室溫下封閉1～2 h，加入BDNF抗體、PSD95抗體、突觸蛋白-1抗體，4 ℃孵育過夜，次日用熒光二抗孵育1 h，再用TBST清洗，用紅外成像系統(tǒng)掃膜，再用Odessay軟件對灰度值進行測定，以GAPDH內參，用目的條帶灰度值對比GAPDH條帶灰度值的比值，來反映目的蛋白的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 3組BDNF、PSD-95及突觸蛋白-1水平對比

由表1可見，七氟醚1組的BDNF、PSD-95、突觸蛋白-1水平均明顯低于空白組；七氟醚2組的BDNF、PSD-95、突觸蛋白-1水平明顯低于空白組及七氟醚1組，P<0.05。

表1 3組BDNF、PSD-95及突觸蛋白-1水平對比

*P<0.05，與空白組比較；#P<0.05，與七氟醚1組比較。

2.2 3組水迷宮實驗各指標對比

由表2可見，七氟醚1組第2、3、4、5天的逃避潛伏期均明顯高于空白組，穿越原平臺位置次數(shù)、第4象限滯留時間均明顯低于空白組，而七氟醚2組第2、3、4、5天的逃避潛伏期均明顯高于空白組及七氟醚1組，穿越原平臺位置次數(shù)、第4象限滯留時間均明顯低于空白組及七氟醚1組，P<0.05。

表2 3組水迷宮實驗指標對比

*P<0.05，與空白組比較；#P<0.05，與七氟醚1組比較。

3 討論

隨著麻醉技術及外科手術的發(fā)展，全世界每年約有150萬例小兒需接受全身麻醉[4]。小兒期的中樞神經系統(tǒng)多是發(fā)育的高峰期，10日齡大鼠腦生長期相當于人類年齡的1歲，其神經系統(tǒng)處在突觸快速發(fā)育階段，是神經系統(tǒng)容易受到損傷的階段[5]。七氟醚血/氣分配系數(shù)較低，麻醉誘導快、蘇醒快，對患者氣道刺激較小，在小兒全麻誘導及維持中有顯著優(yōu)勢，但可能導致發(fā)育期腦組織的神經元凋亡，甚至損傷患兒的學習、記憶功能，目前其作用機制尚不明確。因此，本文探討七氟醚影響神經發(fā)育期大鼠遠期認知功能的機制，以為臨床小兒安全麻醉用藥提供依據(jù)。

大鼠的最低肺泡有效濃度(MAC)隨著年齡的增加逐漸增加，10日齡大鼠的MAC值約為3.54%，本文10日齡大鼠七氟醚吸入2.8%七氟醚，接近臨床小兒麻醉時常用的七氟醚濃度[6]，且并未引起大鼠呼吸、循環(huán)功能抑制。

水迷宮實驗是一種用于動物行為學研究的經典方法，其重復性、穩(wěn)定性好，記錄大鼠逃避潛伏期時間可以反映大鼠的學習能力，記錄穿越原平臺位置次數(shù)、平臺所在象限停留時間可反映大鼠的空間記憶能力。本文結果表明，七氟醚1組第2、3、4、5天的逃避潛伏期均明顯高于空白組，穿越原平臺位置次數(shù)、第4象限滯留時間均明顯低于空白組，表明吸入七氟醚2 h降低了大鼠的學習、記憶功能；而七氟醚2組第2、3、4、5天的逃避潛伏期均明顯高于空白組及七氟醚1組，穿越原平臺位置次數(shù)、第4象限滯留時間均明顯低于空白組及七氟醚1組，表明吸入七氟醚4 h較未吸入、吸入2 h對大鼠的學習、記憶功能影響更大，七氟醚麻醉可能會引起大鼠遠期認知功能障礙，且影響程度與七氟醚吸入時間有關，吸入時間越長，認知功能損害越嚴重。

大腦海馬突觸可塑性與學習、記憶、情緒、行為等功能密切相關，是學習記憶的神經生物學基礎，BDNF、PSD-95、突觸蛋白-1對突觸的發(fā)生、穩(wěn)定及可塑性調節(jié)有重要作用。BDNF支持神經元發(fā)育、分化及維持，可促進受損神經元的恢復，參與突觸可塑性，來維持中樞神經系統(tǒng)學習及記憶功能；PSD-95可調節(jié)谷氨酸受體功能，在突觸傳遞中有重要作用，會對突觸后可塑性造成影響；突觸蛋白-1對突觸囊泡中神經遞質釋放進行調控，也會影響突觸前可塑性[7-8]。本文結果表明，七氟醚1組的BDNF、PSD-95、突觸蛋白-1明顯低于空白組；七氟醚2組的BDNF、PSD-95、突觸蛋白-1明顯低于空白組及七氟醚1組，表明隨著七氟醚吸入時間的延長，BDNF、PSD-95、突觸蛋白-1蛋白水平逐漸降低，說明七氟醚降低了神經發(fā)育期大鼠的BDNF、PSD-95、突觸蛋白-1水平，而通過抑制海馬神經元突觸可塑性，影響大鼠的遠期認知功能。

綜上所述，七氟醚可能通過降低BDNF、PSD-95、突觸蛋白-1水平，抑制海馬神經元突觸可塑性來影響大鼠的遠期認知功能，影響程度隨麻醉時間延長而增加，因此臨床小兒應用七氟醚麻醉時，應盡量縮短麻醉時間。

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