肺鱗癌及腺癌中NGAL表達的免疫組化研究

王彩紋，劉翼軍，熊國亮，余少良

(江西省胸科醫院，江西 南昌330006)

中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL) 是lipocalin家族的一個成員，在中幼粒細胞和晚幼粒細胞分化階段合成，其功能尚不清楚[1]。以前的研究顯示NGAL可能參與多樣的生化過程，涉及胚胎發育、細胞分化、炎癥免疫應答、細胞凋亡、脂質代謝、腫瘤的發生發展等等[2]。因其在人類多種腫瘤及炎癥組織細胞中異常表達，且可能參與免疫炎癥反應以及腫瘤的發生發展，近年來已成為腫瘤相關研究領域的一個新熱點。本研究旨在通過免疫組化技術檢測NGAL在肺鱗癌及腺癌組織中的表達，探討NGAL在其臨床和病理診斷中可能的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年3月至2011年3月在江西省胸科醫院手術治療并獲得其目前轉移等情況資料的肺鱗癌35例及腺癌30例(男42例；女23例)作為實驗組，并取其中及相應42例(男28女14)癌旁肺組織(遠離腫瘤組織至少5cm，另23例因取材原因舍棄)為對照組，年齡23～72歲，中位年齡47歲；所有患者術前均未進行放化療及內分泌治療，據2008年WHO肺癌分類標準進行組織學分類：鱗癌35例，腺癌30例，高分化5例，中分化51例，低分化6例。依據國際抗癌聯盟2009年修訂的肺癌TNM分期標準進行分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期26例，Ⅲ期23例；伴有淋巴結轉移的患者31例，無淋巴結轉移的患者34例。所有患者術前均未行化療、放療等輔助治療。以上標本手術切取后立即置于液氮中保存備用，其余部分常規送病理檢查。

1.2 試劑 鼠抗人NGAL單克隆抗體 (NGAL，sc－07，1∶200)， 購于美國圣克魯斯生物技術公司，(貨號sc-80234)，免疫組化SP法試劑盒及 DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法 68℃烤片20min后,常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；3%H2O237℃孵育10min，PBS沖洗3次(每次不少于5min)；抗原修復后以羊血清工作液封閉，37℃孵育10min加一抗于4℃ 冰箱過夜，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照；滴加生物素標記二抗,37℃孵育30min,PBS沖洗后滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液；二氨基聯苯胺(DAB)顯色，自來水充分沖洗后，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封片。

1.4 結果判定 NGAL的表達以細胞漿有棕黃色著色為陽性，所有切片均由本院2位資深病理醫師采用雙盲法觀察切片，每張切片隨機選取4個高倍視野(×400)，各計數200個細胞。具體判斷標準為無色0分，淡黃色1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；另根據染色程度及陽性染色細胞數占腫瘤細胞總數的百分比來綜合計分，陰性為0分，陽性細胞率≤10%為1分，11%～50%為2分，＞50%為3分；將二者之乘積記為陽性標記指數(label index，LI)，以此判斷表達強度，將LI分為四個等級，0～2 分視為陰性(-)，3～4 分為弱陽性(+)，5～6 分為中等陽性(++)，＞6 分為強陽性(+++)[3]。

1.5 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件，各組間率比較采用χ2檢驗，分析 NGAL蛋白間關系采用Spearman等級相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 在35例鱗癌、30例腺癌及相應42例癌旁組織中，NGAL蛋白的陽性表達均呈棕色顆粒分布，其中在肺腺癌及鱗癌組織中陽性表達則主要表達于細胞漿，局部、灶性和彌漫性表達均有，腺癌中彌漫性表達比鱗癌相對較多；遠癌肺組織中陽性表達則主要表達于細胞膜內表面，極少細胞有彌散性表達(圖1)。陽性對照可見明顯胞漿陽性信號顯示，陰性對照則無陽性信號顯示。NGAL蛋白在30例肺腺癌中有14例呈強陽性表達 (46.7%)，11例呈陽性表達(36.7%)，5例呈陰性表達(16.7%)；在35例鱗癌中有8例呈強陽性表達(22.9%)，13例呈陽性表達 (37.1%)，14例NGAL蛋白呈弱陽性或陰性表達 (40.0%)(表1)；而對照的42例癌旁組織中，僅12例呈陽性表達(28.6%)，NGAL蛋白在肺腺癌組織中的陽性表達率顯著高于鱗癌，其在肺鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率又顯著高于其癌旁組織(P＜0.05)。

2.2 NGAL的表達在所查肺癌病例中，有淋巴結轉移的陽性表達率 (83.9%)高于無淋巴結轉移者(58.8%)，差異有統計學意義(P=0.004)。且NGAL的陽性表達率隨著TNM分期的升高而升高，I期、II期、III期患者中分別為56.3%、69.2%、82.6%，差異有統計學意義(P=0.024)。其表達與患者性別、年齡、吸煙無關(P>0.05)(表1)。

圖1 肺腺癌、鱗癌及癌旁正常組織中NGAL蛋白的表達(SPх400)

3 討論

非小細胞肺癌是全球發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中約有80%為腺癌及鱗癌，近年來其發病率在我國呈上升和年輕化趨勢，其發生、發展和轉移均涉及極其復雜的多基因調控異常過程[3]。因此，研究肺癌的病因、發病機制具有重要的臨床意義。

Lipocalin家族均有著一個高度保守的由8條反向平行的折疊桶狀三級結構，可與疏水性小分子結合，也可與某些細胞膜受體結合,NGAL作為Lipocalin家族的一員，在細胞內環境穩定或免疫調節中扮演重要角色，除中性粒細胞外，正常情況下，NGAL蛋白亦可在腔道表面組織細胞微量表達，如呼吸系統的肺泡間巨噬細胞、消化系統的胃壁細胞小腸部分潘氏細胞、肝膽管細胞、前列腺上皮細胞等。但在機體呈病理狀態時，其表達程度明顯上調，眾多學者認為是因其在抗感染中發揮的重要作用而引起[4]，進一步研究證實，NGAL蛋白還可能作為一種新的癌基因，在許多腫瘤中表達上調[5]。

本研究通過檢測NGAL蛋白在65例肺癌患者的癌組織及癌旁組織中的表達，探討其在肺鱗癌及腺癌的發生發展過程中的作用，進一步證實了NGAL作為一種癌基因的可能性。并探討其與肺癌患者組織類型、性別、年齡、吸煙情況、分化程度和淋巴結轉移情況的關系，從而進一步探討NGAL在肺癌中的作用。發現NGAL在肺腺癌組織比肺鱗癌組織中有較高陽性表達率，且二者的陽性表達率均遠高于癌旁正常肺組織，說明NGAL有可能成為肺鱗癌及腺癌診斷和判斷預后的標志物。有研究表明NGAL蛋白是一種新的鐵離子轉運載體，與其受體一起介導了一條功能不同于轉鐵蛋白的新的鐵離子的傳導通路[6]。未與鐵離子結合的NGAL蛋白能夠清除表達NGAL受體細胞中的鐵離子，使細胞內的鐵離子水平降低，而引起細胞凋亡。結合鐵離子的NGAL蛋白不能誘導細胞凋亡[7]。當然這僅僅是推斷，在肺癌中還沒有相關的驗證，我們可以以此為理論依據進行研究肺癌的發生機制。

表1 NGAL的表達水平與肺鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系

[1]Dizin E,Hasler U,Nlandu-Khodo S.Albuminuria induces a proinflammatory and profibrotic response in cortical collecting ducts via the 24p3 receptor[J].Am J Physiol Renal Physiol，2013,305(7):1053-1063.

[2]蔣奶貴,許麗艷,郭明洲.腫瘤相關蛋白 NGAL的生物學特征[J]．胃腸病學和肝病學雜志,2010,19(4)：297-301.

[3]Correnti C,Richardson V,Sia AK,et al.Siderocalin/Lcn2/NGAL/24p3 does not drive apoptosis through gentisic acid mediated iron withdrawal in hematopoietic cell lines[J].PLoS One,2012,7(8):e43696.

[4]丘佳明.乳腺癌患者腫瘤細胞 NGAL水平免疫組織化學測定的臨床意義[J].放射免疫學雜志,2012,25(5):546-548.

[5]王彩紋,王小中.NGAL基因克隆載體的構建與鑒定[J].實驗與檢驗醫學,2009,27(3):217-219.

[6]Miethke M,Skerra A.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin expresses antimicrobial activity by interfering with L-norepinephrine-mediated bacterial iron acquisition[J].Antimicrob A-gents Chemother,2010,54(4):1580-1589.

[7]Bao G,Clifton M,Hoette TM,et al.Iron traffics in circulation bound to a siderocalin(Ngal)-catechol complex[J].Nat Chem Biol,2010,6(8):602-609.