桔梗皂苷對哮喘小鼠氣道炎癥保護作用的研究

★ 謝軼群 劉華 倪松石 (.如皋市中醫院呼吸內科 江蘇如皋6500;.南通大學附屬醫院呼吸內科 江蘇 南通6000)

支氣管哮喘是臨床常見病、多發病和難治病，是世界范圍內最常見的呼吸系統疾病之一，全球約有3億以上的人患哮喘，是世界公認的醫學難題，被世界衛生組織列為疾病中四大頑癥之一。西醫盡管采用了吸入糖皮質激素及支氣管舒張劑等藥物控制哮喘的急性發作和氣道的慢性炎癥，但由于治療周期長、病人依從性差及藥物副作用等問題，使其臨床應用受到一定的限制。中醫中藥由于取材方便、價格低廉、副作用少等優點近年來受到臨床科研工作者及患者的青睞。桔梗在治療支氣管哮喘的中藥復方或湯劑中發揮著重要作用，然而桔梗治療支氣管哮喘的機制并未得到驗證。研究者擬通過構建支氣管哮喘的動物模型，以地塞米松作為對照藥物研究桔梗皂苷對哮喘氣道炎癥的保護作用，初步揭示桔梗皂苷發揮臨床療效的機制，為其臨床應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 動物 BALB/c小鼠32只，清潔級，體重20～25g，雌性。購自中國科學院上海動物中心，動物證號SCXKL(滬)2006－0003。

1.2 試劑 卵白蛋白(OVA)、乙酰膽堿(Ach)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、地塞米松(均為Sigma公司，美國);桔梗皂苷、IL－4，IL－13試劑盒(均為Bisource公司，美國)。

1.3 儀器 呼吸機及分析系統(北京新奧成科技有限公司);酶標儀(Sunrise，奧地利);S－888E型超聲霧化器(南京道芬電子有限公司);熒光倒置顯微鏡及圖像分析系統(Carl Zeiss，德國);動物肺功能體描箱(北京新奧成科技有限公司);真空凍干機(LABCONCO，美國)。

1.4 試驗方法 實驗方法參照劉華［1］等的方法，將BALB/c小鼠隨機分為四組，每組8只。分別為磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組(A組)，卵白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏組(B組)，OVA+桔梗皂苷組(C組)，OVA+地塞米松組(D組)。B、C、D三組小鼠分別于實驗起始，第2周末和第3周末腹腔注射OVA和氫氧化鋁的混懸液200μL，第4周開始連續10d(每天20min)霧化吸入1%w/v OVA溶液;在此基礎上C組和D組小鼠分別予以灌胃桔梗皂苷25mg/kg和以腹腔注射的方式給予DXM5mg/Kg/d，連續10d。對照組小鼠以PBS作為對照。小鼠最后一次干預后一天予以麻醉后檢測肺功能及檢測灌洗液上清測白介素4，白介素13(IL－4、IL－13)，沉渣行瑞氏－吉姆薩染色做細胞分類和計數，最后處死動物取肺組織做病理形態學檢查。

1.4.1 哮喘小鼠氣道反應性測定 實驗鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，行氣管插管。小鼠尾靜脈穿刺，按照下述濃度梯度注入Ach，連接動物肺功能儀，設置參數:呼吸100次/分，潮氣量5－6mL/kg處理以不同濃度梯度Ach激發支氣管，以其肺阻力(lung resistance RL)表示氣道反應性。Ach濃度分別為基線值以及 0.5，1.5，5，15，45g/L。

1.4.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)炎癥細胞計數小鼠行氣管插管，支氣管肺泡灌洗，回收率約60%～70%，離心后取上清分裝保存待測IL－4、IL－13。沉渣行炎癥細胞的分類和計數。

1.4.3 BALF上清液 IL－4、IL－13測定 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)按試劑盒說明書進行。

1.4.4 哮喘小鼠肺組織病理形態學檢查 小鼠處死后，取新鮮肺組織酒精固定，制備蠟塊，切片后常規蘇木精－伊紅染色(H＆E)染色。

1.5 統計學分析 應用SPSS 17.0統計學分析軟件，對本實驗所有數據資料進行分析。實驗數據采用均數士標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 哮喘小鼠氣道高反應性測定 見表1。

表1 各組小鼠氣道阻力比較(±s，n=8)

表1 各組小鼠氣道阻力比較(±s，n=8)

注:與A組比較，aP＜0.05;與 B組比較，bP＜0.05;與 C組比較，cP ＞0.05。

組別RL(cmH2O/mL/s)0.5g/L 1.5g/L 5g/L 15g/L 45g/L A 1.10±0.16 1.17 ±0.14 1.22±0.14 2.40±0.20 3.基線30 ±0.56 5.31 ±1.77 B 1.20±0.16 1.26 ±0.90 1.45±0.24 3.76 ±0.43a6.92±0.53a14.88 ±2.59a C 1.20±0.15 1.28 ±0.18 1.33±0.26 1.89±0.45b3.22±0.73b 7.76±1.43b D 1.15±0.18 1.18 ±0.36 1.17±0.35 1.78 ±0.16bc2.34±0.61bc4.56±1.98bc

2.2 BALF炎癥細胞的分類和計數 見表2。

表2 各組小鼠BALF中炎癥細胞計數比較(×109/L，±s，n=8)

表2 各組小鼠BALF中炎癥細胞計數比較(×109/L，±s，n=8)

注:與 A 組比較，aP＜0.05;與 B組比較，bP＜0.05;與 C比較，cP ＞0.05。

組別 嗜酸性粒細胞 中性粒細胞 巨噬細胞 淋巴細胞A 0.89 ±0.16 2.89 ±2.34 16.28 ±1.99 2.25 ±0.74 B 84.25±6.78a 13.65 ±4.89a 21.75±2.45a 16.50 ±2.76a C 16.25 ±6.34b 8.50 ±2.86b 21.34 ±3.70 16.00 ±2.39 D 18.21±3.16bc 5.60 ±2.18bc 17.60±2.32b 4.50±0.95b

2.3 BALF細胞因子IL－4、IL－13檢測結果 見表3。

表3 各組小鼠IL－4、IL－13濃度比較(±s，n=8)/pg·mL－1

表3 各組小鼠IL－4、IL－13濃度比較(±s，n=8)/pg·mL－1

注:與A組比較，aP＜0.05;與 B組比較，bP＜0.05;與 C組比較，cP ＞0.05。

組別IL－4 IL－13 A 9.50 ±2.60 8.60 ±2.44 B 48.00 ±5.62a 63.36 ±8.39a 10.32 ±3.78b 11.33 ±2.90b D 11.39 ±3.80bc 28.00 ±5.380 C b

2.4 哮喘小鼠肺組織病理形態學結果 見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態學結果

3 討論

支氣管哮喘是由多種細胞(如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，這種慢性炎癥與氣道高反應性相關，氣道高反應性是指氣道對各種特異性或非特異性刺激反應性增高，以氣道平滑肌的過早或過強的收縮反應、支氣管痙攣、黏液腺體分泌亢進為主要臨床表現。

IL－4是B細胞刺激因子，其主要作用是誘導B細胞活化、增殖、分化及IgE的分泌，也可以直接誘導IgM或IgG轉化為IgE，IgE是哮喘發病過程中的重要抗體，IgE的過量產生，促使了I型變態反應的發生。IL－4能釋放IL－4到細胞外微環境，激活T細胞產生更多的IL－4，能促使肥大細胞的增殖、分化、成熟，激活的肥大細胞，啟動炎癥細胞募集、趨化［2］。IL－4是早期T細胞誘導炎癥反應啟動因素，并對嗜酸粒細胞及其他炎癥細胞有強大的化學趨化作用，可顯著增加氣道內炎癥細胞的聚集、活化，增強氣道高反應性［3］。IL－13與IL－4由相同細胞產生，它們具有共同的信號傳導途徑，調節途徑也相同，有相似的生物學活性，是可以直接促進IgE合成的細胞因子之一［4］。IL－13在所有與哮喘有關的細胞因子中占具重要的地位，可以在沒有其他細胞因子的情況下，單獨介導引起哮喘。IL－13可引起嗜酸粒細胞聚集，黏液分泌增加，導致氣道炎癥及氣道高反應性，在氣道重塑中起著重要作用，是形成氣道高反應性所必需的細胞因子。有研究顯示，在IL－13缺如時，即使有大量的IL－4、IL－5以及明顯的氣道嗜酸粒細胞浸潤，氣道高反應性也不能產生［5］。

本研究通過建立哮喘小鼠模型，應用桔梗皂苷進行干預，探討其對氣道炎癥的保護作用及可能機制。結果表明，哮喘小鼠存在嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、IL－4、IL－13表達的上調，桔梗皂苷可抑制哮喘小鼠氣道炎癥反應，降低氣道阻力。抑制嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、IL－4、IL－13的表達可能是其機制之一。但其具體作用機制尚未十分清楚，還需要進一步深入探討。

［1］劉華.β2腎上腺素能受體減敏及其激素保護作用的蛋白質組學研究［D］.南京:南京醫科大學，2008.

［2］Ochi H，Hirani WM，Yuan Q，et al.T helper cell type 2 cytokine －mediated comitogenic responses and CCR3 expression during differentiation of human mast cells in vitro［J］.Exp Med，1999，190(2):267－280.

［3］楊學敏，史孩廣，成家軍，等.白介素4在支氣管哮喘發病機制中的作用及其靶向治療研究［J］.中華哮喘雜志，2011，5(2):112－116.

［4］范新蕾，田鋒，田洪德.白介素與支氣管哮喘相關關系的研究進展［J］.臨沂醫學專科學校學報，2005，27(1):45 －47.

［5］David M，walter JJ，Mcintire GB，et al.Critical role of IL － 13 in the development of allergen－induced airway hyperreactivity［J］.Immunol，2001，167(8):4 668 －4 675.