神安顆粒苷類成分的指紋圖譜研究

★ 李堅 易延逵 蔡光先 楊永華 (1.漣源市人民醫院藥劑科 湖南 漣源417100;2.南方醫科大學 廣東 廣州510515;.湖南中醫藥大學 湖南長沙410006)

天然產物指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，它是建立在天然產物化學成分系統研究的基礎上，主要用于評價天然產物及其半成品、成品質量的真實性、優良性和穩定性。目前指紋圖譜已成為國際公認的控制天然產物(尤其是中藥)質量的最有效手段［1－3］。

神安顆粒是由天麻、五味子、丹參、百合花、酸棗仁、首烏藤等組成，具有補腦安神、寧心除煩之功效。其基本工藝為:天麻粉碎成微粉;丹參、五味子、百合花加90%乙醇滲漉提取其極性較小脂溶性成分;丹參、五味子、百合花醇提后藥渣與酸棗仁、夜交藤加水提取，最后加入適量輔料制成顆粒。神安顆粒主要成分如下幾類:以天麻素為代表的較高極性苷類成分;存在于丹參、五味子、百合花中的丹參醌類、五味子木脂素類成分、百合花色素類等脂溶性成分;另含有以斯皮諾素為代表的苷類成分，丹參素類成分。神安顆粒所含成分較復雜，要想制定其指紋圖譜可采用制定其“全指紋圖譜系”來全面控制其質量。神安顆粒的“全指紋圖譜系”應有以上各類成分的信息。本文主要探討神安顆粒中以天麻素為代表的苷類成分指紋圖譜的制定。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent數據處理軟件;SK1200H型超聲器(上海科導超聲儀器有限公司);

天麻素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110736－200423，供含量測定用);磷酸為色譜純試劑(Fisher)，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。

天麻、五味子、丹參、百合花、酸棗仁、首烏藤等藥材(長沙海川醫藥有限公司)，神安顆粒(自制)。

2 方法與結果

照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI D)，參照指紋圖譜的有關技術要求進行測定［4］。

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱:C18柱;流動相:0.05%磷酸溶液;檢測波長:220nm。理論板數按天麻素峰計算應不低于5000［5］。

2.1.2 供試品溶液的制備 取神安顆粒0.25g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加稀乙醇10mL，精密稱定，超聲(功率200W，頻率40kHz)提取 30min，放冷，再精密稱定重量，減失的重量用稀乙醇補足，濾過，取續濾液5mL，濃縮至近干，殘渣加稀乙醇溶解，轉移至10mL量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2.1.3 參照物的選擇和制備

神安顆粒中苷類成分主要為天麻中的苷類成分，天麻素為天麻的指標成分，因而選用天麻素為參照物。

對照品溶液的制備:精密稱取天麻素對照品(80℃干燥1h)適量，加流動相制成每1mL中含天麻素50μg的溶液，即得。

2.1.4 測定法

分別精密吸取參照物溶液10μL與供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，依法測定，記錄時間為50min。以天麻素的色譜峰(S峰)的保留時間和峰面積為1計算其它各峰相對保留時間和相對峰面積。相似度評價采用“中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統”進行。

表1 十批神安顆粒樣品中苷類成分各共有峰的相對保留時間

圖1 HPLC圖譜

2.1.5 神安顆粒中苷類成分指紋圖譜的建立(1)共有指紋峰的標定 共有指紋峰采用相對保留時間標定，以圖譜中天麻素為參照物，將各色譜峰保留時間與同一圖譜中參照物天麻素的保留時間比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間，計算神安顆粒10個批次指紋圖譜中各色譜峰的相對保留時間，結果見表1。其中5個色譜峰為各批次神安顆粒所共有，故標定它們為共有指紋峰，結果見圖1。5個共有指紋峰的相對保留時間分別為峰－1(0.2558～0.2566)、峰 － 2(0.3481 ～ 0.3521)、峰 － 3(0.4429 ～0.4446)、峰 －4(0.4963 ～0.5016)、峰 －S(1.0000)。

(2)共有指紋峰的相對峰面積 以圖譜中天麻素為參照物，將各色譜峰峰面積與同一圖譜中參照物天麻素的峰面積比較，其比值為各色譜峰的相對峰面積，結果見表2。因神安顆粒中苷類成分指紋圖譜峰數少，對單峰峰面積占總峰面積＜10%的共有峰也進行了計算。

表2 十批神安顆粒樣品中苷類成分各共有峰的相對峰面積

(3)相似度評價 相似度評價采用“中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統”，自動譜峰匹配。結果見圖2。結果10批樣品的相似度均在0.80以上。

圖2 相似度計算(全譜)圖

2.1.6 方法學考查 (1)精密度試驗 取同一份神安顆粒的供試品溶液，連續測定5次，對色譜中各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積進行統計，結果各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，結果見表3～4。結果符合指紋圖譜精密度的要求(RSD＜2%)。

表3 相對保留時間精密度結果(n=5)

(2)重復性試驗取同一批神安顆粒樣品5份，分別按“2.1.2項下供試品溶液制備方法”制備成供試品溶液，依法測定，對色譜中各共有指紋峰的相對保留時間、相對峰面積進行統計，結果各共有指紋峰的相對保留時間、相對峰面積基本一致，結果見表5～6。符合指紋圖譜重復性的要求(RSD＜2%)。

表4 相對峰面積精密度結果(n=5)

表5 相對保留時間重復性結果(n=5)

表6 相對峰面積重復性結果(n=5)

(3)穩定性試驗取同一份神安顆粒的供試品溶液，分別在以下時間進樣:0，2，4，6，8h，對色譜中各共有指紋峰的相對保留時間、相對峰面積結果進行統計，結果各共有指紋峰的相對保留時間、相對峰面積基本一致，表明神安顆粒供試品溶液在8h內穩定，結果見表7～8。結果符合指紋圖譜穩定性的要求(RSD＜2%)。

表7 相對保留時間穩定性結果(n=5)

表8 相對峰面積穩定性結果(n=5)

2.1.7 指紋圖中指紋峰與藥味的相關性考查 為了確定神安顆粒“全指紋圖譜系”中苷類成分指紋圖譜中指紋峰的來源，需要考查缺味神安顆粒和藥材的指紋圖譜，通過與相應缺味陰性樣品和藥材進行對比分析，考查指紋圖中指紋峰與藥味的相關性。這里主要對苷類成分指紋圖譜與天麻藥材的相關性進行考查。

2.1.7.1 供試品溶液的制備 天麻供試品溶液制備:按供試品溶液制備方法，取天麻藥材粗粉1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10mL，稱定重量，超聲處理(功率:240W，頻率:45Hz)1h，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續濾液，即得。

陰性供試品溶液制備:取缺天麻藥材的神安顆粒約1g，按上述制備方法進行制備。

2.1.7.2 色圖譜的制定 分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，記錄50分鐘的色譜圖。分別比較各待測溶液指紋圖譜，結果見圖3。結果表明神安顆粒苷類成分指紋圖譜s號峰來源于天麻。

圖3 指紋圖譜對比分析

3 討論

3.1 神安顆粒“全指紋圖譜系” 中藥的“全指紋圖譜系”應根據方中藥物的信息、成分分析、功能主治相關藥效作用等，確定中藥所含有的具體各類成分，進而根據每一類成分的提取方法和儀器條件制定出相應的指紋圖譜，并進一步確定中藥“全指紋圖譜系”中每張指紋圖譜中每一個指紋峰的來源。在對神安顆粒指紋圖譜的研究中，因神安顆粒成分復雜，一張指紋圖譜難以反映大部分成分的信息，故進行了“全指紋圖譜系”研究，建立了以天麻素為代表的苷類成分、以五味子醇甲為代表的脂溶性成分和以斯皮諾素為代表的水溶性成分的指紋圖譜，主要探討了以天麻素為代表的苷類成分指紋圖譜的研究，并與天麻藥材和缺天麻樣品進行了相關性分析，確定了部分指紋峰的來源。

3.2 區間指紋圖譜的構思 針對指紋圖譜分析結果中雜質峰群存在，本文提出了“區間指紋圖譜”的構建，即是建立某一區間的指紋圖譜:整個指紋圖譜把它分為幾個區間(時間段)，在一定區間內可能雜質峰群比較集中，可不對這一區間的雜質峰群進行指紋峰的定位，而對一定區間內色譜峰均分離較好的組峰尤其是參比峰所在區間進行指紋峰的定位，從而構建起這一區間的指紋圖譜。這可以很好的解決指紋圖譜研究中出現的雜質峰群問題，從而為天然產物指紋圖譜的建立打開了新的思路和方法，也為指紋圖譜建立的可行性提供了更多的試驗依據。

3.3 神安顆粒“區間指紋圖譜” 在對神安顆粒指紋圖譜的研究中，因神安顆粒成分復雜，故建立神安顆粒中以天麻素為代表的苷類成分指紋圖譜。在研究以天麻素為代表的苷類成分指紋圖譜中，優化了色譜條件。在區間0～10min內有大量的雜質峰群，而在區間10～50min內主要指紋峰分離較好，因而選擇了這一區間建立了神安顆粒苷類成分的指紋圖譜。

［1］Natalie Lazarow ych.Use of Fingerprinting and Marker Compounds for Identification and Standardization of BotanicalDrugs:Strategies for Applying Pharmaceutical HPLC Analysis to Herbal Products［J］.Drug Inf ormation Journal，1998，32:497 －512.

［2］Peter John Houghton.Establishing Identification Criteria for Botanicals［J］.Drug In formation Journal，1998，32:461 －469.

［3］任德權.中藥指紋圖譜質控技術的意義與作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2001，12(3):135 －140.

［4］國家食品藥品監督管理局.關于印發《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》的通知［J］.中成藥，2000，22(10):671－675.

［5］黃小玲，楊春燕，袁慧文.天麻藥材高效液相色譜指紋圖譜研究［J］.中國藥業，2011，20(2):17 －19.