水蛭提取物對HL60細胞增殖與細胞周期的影響

★ 肖移生 侯吉華 李青 汪建民＊ (江西中醫藥大學基礎醫學院 江西 南昌330004)

中藥水蛭性咸、苦、平，歸肝、膀胱經，有破血瘀、散結聚、通經脈、利水道等功效，用于治癥瘕、痞塊、血瘀閉經、跌打損傷等，其藥理作用為抗凝、溶栓、抗血小板及降血脂等［1］;臨床上水蛭也可單方或組方運用于腫瘤治療中［2］。本課題組前期研究發現水蛭提取物對HL60細胞生長有抑制作用［3］，為進一步探討，本課題組進行了水蛭提取物對HL60細胞增殖與細胞周期影響的實驗。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養方法 HL60細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心，由江西中醫藥大學基礎醫學院實驗中心保存，將HL60細胞培養于含有10%新生小牛血清的RPMI1640完全培養基中(37℃，5%CO2飽和濕度培養)，培養至細胞處于對數生長期用于后續實驗。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養基及新生小牛血清為美國GIBCO公司產品;全反式維甲酸(All transretinoic acid，ATRA)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、佛波酯(TPA)、碘化丙啶(PI)、RNase A均為美國Sigma公司產品;鼠抗人Cyclin E、CDK2抗體均為美國Santa Cruz公司產品;HRP標記的羊抗鼠IgG二抗、GAPDH內參抗體均為北京中杉金橋公司產品。其余未說明的試劑均為國產分析純級試劑。

1.3 藥物 水蛭原藥材購于江西中醫藥大學附屬醫院中藥房，并經我校中藥資源學科組鄧可眾副教授鑒定且符合國家中藥臨床應用標準。水蛭用超微粉碎機粉碎，提取物以液氮快速凍融法制備［4］:取水蛭超微粉1.5g置15mL離心管內，加10mL無菌雙蒸水制成混懸液，再將離心管置液氮內5min，取出，立即放入37℃水浴中迅速融解，重復3次，再3000r/min離心10min。取上清液過濾，濾液冷凍干燥18h即得水蛭凍干粉，－20℃保存備用，臨用前用培養基配成實驗所需濃度工作液，再經0.22um無菌濾器正壓過濾除菌。

1.4 MTT試驗 取對數生長期的HL60細胞以5.0×104/mL細胞濃度置于96孔培養板內培養，同時用水蛭提取物(根據前期實驗結果［3］，設 0.7、1.4、2.8g/L，為水蛭提取物凍干粉的劑量)再處理HL60細胞48h，同時設正常對照孔及陽性藥物(ATRA)對照，到時間點后各孔加入MTT液20μL/孔，每組10個復孔，4h后終止培養，以1000r/min離心5min，去除上清，加入 DMSO(150 μL/孔)使結晶物溶解，用自動酶標儀波長490nm處測吸光度A值，實驗重復5次，得出量效關系。按下列公式計算細胞抑制率:細胞生長抑制率(%)=(對照孔A值－試驗孔A值)/對照孔A值×100%。

1.5 FCM檢測HL60細胞周期 收集各組細胞，每組細胞數約2.0×106個，離心后棄上清，用冷PBS漂洗，加冷70%乙醇固定，4℃過夜;次日離心后棄乙醇，用PBS漂洗2遍，加入 PI(100ug/mL)10μL、RNase A(5ug/mL)10μL、并加入PBS液至總體積達500μL，于室溫下避光作用30min，然后上流式細胞儀(FCM)行細胞周期檢測。實驗重復10次。

1.6 Western blotting法檢測Cyclin E、CDK2 蛋白表達 按照操作說明，用裂解液提取組織總蛋白;BCA法測總蛋白質濃度，8%SDS－PAGE電泳，轉至PVDF膜;室溫下用5%脫脂奶粉封閉1h;然后加一抗(Cyclin E和 CDK2;均為1∶400濃度)，同時以GAPDH(1∶500)為內參，4℃孵育過夜;次日加入HRP標記的羊抗鼠IgG二抗(1∶500)，室溫孵育1h;再用化學發光液在暗室進行曝光顯影。實驗重復5次。

2 結果

2.1 水蛭提取物對HL60細胞增殖的抑制作用各濃度的水蛭提取物處理HL60細胞48h后，MTT檢測結果顯示水蛭提取物以劑量依賴性方式抑制HL60細胞增殖，抑制率隨水蛭提取物濃度增高而增加。各試驗組與正常組比較均有統計學差異(P＜0.05，P ＜0.01)，見表1。

表1 水蛭提取物對HL60細胞增殖的抑制作用(±s，n=50)

表1 水蛭提取物對HL60細胞增殖的抑制作用(±s，n=50)

注:與正常組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 濃度 吸光度 抑制率(%)－ 0.642 ±0.017 －水蛭提取物組 0.7g/L 0.401 ±0.012* 37.89 1.4g/L 0.285 ±0.011＊＊ 55.46 2.8g/L 0.232 ±0.009＊＊ 63.25 ATRA組正常對照組2umol/L 0.273 ±0.009 57.45

2.2 水蛭提取物對 HL60細胞周期的影響 經FCM分析細胞周期結果顯示，水蛭提取物對HL60細胞周期的分布有顯著性影響。隨藥物濃度增高，G1期比例增高，S期比例下降，各藥物組與正常對照組的G1/G0期、S期比例比較均有統計學差異(P＜0.05，P ＜0.01);各組 G2期比例變化不大，無統計學差異，見表2、圖1。

表2 水蛭提取物對HL60細胞周期的影響(±s，n=50)

表2 水蛭提取物對HL60細胞周期的影響(±s，n=50)

注:與正常組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 濃度 G1期(%) S期(%) G2/M期(%)－ 34.75±5.38 53.64 ±6.77 11.14±0.89水蛭提取物組 0.7g/L 45.21±8.17* 45.93±4.16* 15.20±1.86 1.4g/L 52.21±6.32＊＊ 40.22±3.60＊＊ 13.26±0.55 2.8g/L 60.58±7.26＊＊ 30.81±4.37＊＊ 10.66±1.21 ATRA組正常對照組2umol/L 62.49±6.45 32.16 ±2.48 14.32±0.99

2.3 水蛭提取物對HL60細胞Cyclin E、CDK2蛋白表達的影響 Western blotting法檢測各組細胞Cyclin E、CDK2蛋白表達發現，與正常對照(Control)組相比，水蛭中劑量及高劑量處理的兩組HL60細胞其Cyclin E、CDK2蛋白的表達顯著降低，且劑量越高，其抑制效果越明顯(圖2)。

圖1 FCM檢測各組HL60細胞周期圖

圖1 Western blotting檢測各組細胞Cyclin E、CDK2蛋白表達

3 討論

水蛭始載于《神農本草經》，有破血、逐瘀、通經等功效，廣泛用于心腦血管及血栓性疾病的治療，水蛭也是腫瘤疾病治療中常用的一味活血藥。現代研究發現水蛭抗腫瘤的主要活性成份有凝血酶抑制劑及蛋白酶抑制劑等，含量中主要是水蛭素、溶纖素等［5］。我們前期研究發現HL60細胞經過72h完成對數生長期，然后達到平臺期;水蛭提取物濃度高于0.1mg/mL時對HL60細胞有明顯的抑制作用，并呈時間和劑量依賴性，且以48h達最佳藥效作用時間;經計算作用HL60細胞48h時的水蛭提取物IC50=1.4mg/mL，故本研究中將水蛭提取物設為 0.7、1.4、2.8g/L(低、中、高劑量)三個劑量作用 HL60 細胞48h時間段進行研究［3］。

我們的實驗表明，水蛭提取物有良好的抑制HL60細胞增殖作用，2.8g/L的水蛭提取物抑制HL60細胞增殖率達62.25%。經FCM分析細胞周期結果顯示，水蛭提取物對HL60細胞周期的分布有顯著性影響，隨藥物濃度增高，G1期比例增高，S期比例下降，但對G2期比例變化不大，這說明水蛭提取物能阻滯HL60細胞于細胞分裂周期的G1期、阻止進入S期。有研究證實，細胞周期長短主要決定于G1期，G1期阻滯可使細胞周期延長，導致細胞增殖減慢［6］。所以，水蛭提取物具有良好的抑制HL60細胞增殖作用與細胞周期G1期阻滯有關。

細胞周期有兩個限制點，分別是G1/S期及G2/M期，其中G1/S期是啟動細胞周期的關鍵，而Cyclin E又是調節細胞周期從G1期向S期過渡的關鍵因子［7］。CDK2是CDK家族成員之一，可與Cyclin E結合形成功能性復合物，促進細胞周期由G1期向S期過渡，細胞呈現旺盛的增殖能力［8］。筆者運用Western blotting法檢測各組細胞Cyclin E、CDK2蛋白表達發現，水蛭提取物能顯著降低HL60細胞的Cyclin E、CDK2蛋白表達，且劑量越高，其抑制效果越明顯。這就進一步驗證了水蛭提取物抑制HL60細胞增殖是將其細胞周期阻滯于G1期，但其詳細機制有待深入研究。

［1］周樂，趙文靜，常惟智.水蛭的藥理作用及臨床應用研究進展［J］.中醫藥信息，2012，29(1):132 －133.

［2］張娟，張媛.淺談水蛭在腫瘤疾病中的運用［J］.湖南中醫雜志，2006，22(4):69.

［3］肖移生，廖夫生，趙志冬，等.水蛭提取物對人白血病HL－60細胞體外抑制作用研究［J］.江西中醫學院學報，2013，25(4):63－65.

［4］郭永良，田雪飛，肖竺.水蛭提取物對人肝癌HepG2細胞體外抑制作用研究［J］.中國中醫藥信息雜志，2009，16(8):30 －31.

［5］王艷，楊培民，代龍，等.水蛭提取方法及生理活性的研究［J］.中國生化藥物雜志，2012，33(1):27 －30.

［6］Swanton C.Cell－ cycle targeted therapies［J］.Lancet Oncol，2004，5(1):27－36.

［7］Siu KT，Rosner MR，Minella AC.An integrated view of cyclin E function and regulation［J］.Cell Cycle，2012，11(1):57 －64.

［8］Sherr CJ，Roberts JM.CDK inhibitors:positive and negative regulators of G1 － phase progression［J］.Genes Dev，1999，13(12):1 501－1 512.