不同化學處理對稻草體外發酵動態變化的影響

馬艷艷，李袁飛，成艷芬，朱偉云

（南京農業大學動物科技學院消化道微生物研究室，江蘇 南京210095）

稻草是我國反芻動物主要粗飼料之一，但由于其粗纖維含量高，適口性差，消化利用率低，造成了資源浪費及環境污染。為了提高稻草的飼用價值，除了添加礦物質和能量飼料外，生產中常對其進行適當的加工處理。常見的處理方式有物理、化學和生物處理，其中化學處理又包括稀酸處理、堿化處理、氨化處理以及氨堿復合處理。化學處理能降低稻草粗纖維含量，提高粗蛋白含量。陳廣銀等［1］對秸稈進行堿化處理研究表明，堿化處理不僅能破壞木質纖維結構，也能破壞核酸、氨基酸等含氮物的結構，將其中的氮以NO3--N和NH4＋-N的形式釋放，提高氮的利用率。

反芻動物通過瘤胃微生物發酵粗纖維獲得能量，但秸稈中的木質素與纖維素和半纖維素相互交聯［2］，導致瘤胃微生物難以降解利用。而化學處理則可破壞木質素與纖維素、半纖維素間的緊密連接，提高微生物對秸稈的降解率。同時，氨化處理可形成銨鹽，提高秸稈的總含氮量，使微生物合成微生物蛋白所需的氮營養素含量增加，促進微生物增長［3］。王佳堃等［4］利用尿素處理稻草發現，尿素可以破壞纖維酯鍵，使纖維素暴露，加速纖維素和半纖維素的溶解。Rezaeian等［5］研究也發現，堿化處理能夠提高木聚糖酶活性，從而提高秸稈降解能力。

目前，對秸稈化學處理的研究多側重于處理前后營養成分變化的比較，而對瘤胃微生物發酵預處理秸稈的動態變化研究較少。本研究通過體外發酵技術研究化學預處理對秸稈發酵動態變化的影響，尋求提高稻草秸稈降解率的最佳處理方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 稻草采集與化學處理 稻草取自浙江大學農場。選擇清潔、無污染及無霉變樣品于65℃烘干，粉碎過1 mm篩并保存備用。分別添加3.6%NaOH與NH3·H2O、9%NH4HCO3及10%尿素對稻草進行復合堿化、氨化及尿素化處理。將原料混合均勻并拌濕后裝入密封袋中壓緊，堆放15 d后65℃烘干備用。不同化學處理稻草的營養成分含量見表1。

1.1.2 瘤胃液采集及培養基配制 瘤胃液采自南京農業大學江浦農場3頭裝有永久性瘤胃瘺管的健康成年荷斯坦奶牛。每天7：00和17：00飼喂干物質9 kg［青貯玉米秸稈∶苜蓿（Medicago sativa）∶羊草（Leymus chinensis）∶精料＝20∶20∶30∶30；精料主要由玉米（Zea mays）、麩皮、豆粕組成；先粗后精］，自由飲水。早飼前采集瘤胃液并保存于充滿CO2的39℃熱水瓶內，迅速帶回實驗室，整個過程嚴格厭氧。參照Theodorou等［6］方法配制培養基，然后與經4層紗布過濾的瘤胃液在厭氧條件下充分混合（體積比為10∶90），厭氧分裝100 m L／瓶（含1 g發酵底物），39℃靜置培養96 h。

1.2 測定指標與測定方法

1.2.1 常規營養成分分析 按美國公職分析化學師協會（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）［7］的方法測定試驗樣品中干物質（dry matter，DM）、粗蛋白（crude protein，CP）、粗脂肪（ether extract，EE）和粗灰分（ash content，Ash）含量，采用 Van Soest和Robertson［8］的方法測定中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）及酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量。計算底物干物質消失率（disappearance rate of dry matter，DMD）、中性洗滌纖維消失率（disappearance rate of neutral detergent fiber，NDFD）和酸性洗滌纖維消失率（disappearance rate of acid detergent fiber，ADFD）。

表1 不同化學處理稻草營養成分分析Table 1 Chemical composition of experimental roughages %

1.2.2 發酵指標測定 發酵過程中測定動態產氣量，于24，48，72及96 h時結束發酵并測定發酵液p H值、揮發性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）、氨態氮（NH3-N）及微生物蛋白（microbial protein，MCP）濃度。參照Theodorou等［6］的方法測定產氣量；參照秦為琳［9］的方法測定VFA含量；參照 Weathburn［10］的方法測定NH3-N濃度；采用考馬斯亮藍比色法測定MCP濃度。

1.3 數據分析

數據經Excel 2007初步整理后用SPSS 17.0進行One-Way ANOVA分析，用Duncan’s法進行多重比較。試驗結果以平均值±標準誤（Mean±SEM）表示，當P＜0.05時認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同化學處理對稻草體外發酵累計產氣量的影響

圖1 不同化學處理稻草體外發酵96 h累計產氣量Fig.1 Cumulative gas production of rice straw with different chemical treatment in vitroCK：對照組Control；SH：堿化組Sodium hydroxide；AB：氨化組Ammonium bicarbonate；UR：尿素組Urea；下同The same below.

稻草體外厭氧發酵累計產氣量變化見圖1。各處理組體外發酵產氣量變化趨勢基本一致，發酵前36 h累計產氣量迅速增加，隨后增長緩慢。發酵36 h時，堿化組累計產氣量最高，其次為尿素組和氨化組，對照組最低；發酵結束時，各組累計產氣量差異顯著（P＜0.05），堿化組最高，為（208.27±0.87）m L；其次為尿素組和氨化組，分別為（197.15±0.88）和（196.03±0.60）m L；對照組最低，為（192.18±0.43）m L；其中氨化組稻草和對照組差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同化學處理稻草體外發酵DMD、NDFD、ADFD變化

稻草體外發酵DMD、NDFD和ADFD變化見圖2。各處理組DMD、NDFD和ADFD均隨發酵時間的延長逐漸升高，其中堿化組稻草顯著高于其他各組（P＜0.05），對照組最低，尿素組與氨化組間差異不顯著（P＞0.05）。發酵結束時，堿化組與對照組相比，DMD由31.58%提高到51.36%，NDFD由63.62%提高到82.26%，ADFD由64.39%提高到71.37%。

圖2 不同化學處理稻草體外發酵DMD、NDFD、ADFD變化Fig.2 DMD，NDFD，ADFD of rice straw with different chemical treatment in vitro

2.3 不同化學處理稻草體外發酵p H值變化

不同化學處理稻草體外發酵p H值變化見圖3。各處理組發酵液p H值隨發酵時間不斷降低且發酵過程中尿素組p H值均為最高。發酵結束時尿素組和氨化組的p H顯著高于對照組（P＜0.05），堿化組與其他各組差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 不同化學處理稻草體外發酵VFA變化

稻草體外發酵過程中VFA變化情況見表2。隨發酵時間延長，各處理組VFA濃度逐漸升高；堿化、氨化和尿素組乙／丙呈先升高后降低的趨勢，48 h時達到最高，而對照組乙／丙則逐漸降低。發酵結束時，氨化和尿素組發酵液中乙／丙顯著低于其他2組（P＜0.05），其中氨化組和尿素組差異不顯著（P＞0.05），堿化組和對照組差異不顯著（P＞0.05）。發酵不同時間點各處理組相比，堿化組乙酸、丙酸、丁酸以及總揮發酸濃度均顯著高于其他各組（P＜0.05），其次為尿素組和氨化組，對照組最低。

圖3 不同化學處理稻草體外發酵的p H值變化Fig.3 p H value of rice straw with different chemical treatment in vitro

2.5 不同化學處理稻草體外發酵NH 3-N和MCP變化

稻草體外發酵NH3-N及MCP濃度變化見圖4。隨發酵時間延長，對照組和氨化組NH3-N濃度呈先升高后降低趨勢，堿化組和尿素組則為升高－降低－升高。發酵各時間點不同處理組相比，尿素組NH3-N濃度均顯著高于其他各組（P＜0.05），其次為氨化組和堿化組，對照組最低，堿化組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。不同化學處理稻草體外發酵MCP濃度介于13.54～20.64 mg／100 m L之間。隨發酵時間延長，各處理組MCP濃度先升高后降低，發酵48 h時MCP濃度最高。發酵24，48及72 h不同處理組相比，尿素組MCP濃度最高，對照組最低，氨化組和堿化組差異不顯著（P＞0.05），發酵結束時各處理組差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同化學處理稻草體外發酵VFA變化Table 2 VFA of rice straw with different chemical treatment in vitro

圖4 不同化學處理稻草體外發酵NH3-N和MCP濃度變化Fig.4 Concentrations of NH3-N and MCP of rice straw with different chemical treatment in vitro

3 討論

3.1 化學處理對稻草營養成分及發酵特性的影響

本研究中復合堿化、氨化以及尿素化處理均提高了稻草粗蛋白含量，降低了NDF和ADF含量，這可能是因為化學處理不但增加了秸稈非蛋白氮含量，還破壞了木質素與纖維素、半纖維素間的酯鍵，使結構性多糖更易被降解。張浩［11］研究不同處理對稻草營養成分的影響時發現，經氨化處理后稻草粗蛋白含量提高了4.17%，增加了近1倍。邱向峰等［12］對飼用稻草預處理的研究表明，稀堿處理能大量溶出稻草中的半纖維素和木質素，從而提高稻草纖維素的糖化率。

本研究中堿化組累計產氣量和干物質消失率最高，其次是尿素組和氨化組。這與已有報道一致。Liu等［13］研究顯示，堿化稻草體外發酵產氣量顯著高于氨化稻草。龐云芝等［14］研究也顯示，尿素、氨和NaOH處理均能提高稻草體外發酵產氣量，但NaOH效果最好。艾麗霞等［15］對不同纖維底物體外發酵特性的研究表明，粗纖維含量較低，粗蛋白和無氮浸出物含量較高的底物體外發酵產氣量較高。本研究中復合堿處理提高了稻草可發酵纖維比例及粗蛋白含量，從而提高了稻草干物質消失率和總產氣量。

本研究中復合堿化處理顯著提高了發酵液中VFA濃度，氨化處理顯著提高了發酵液中NH3-N及MCP濃度。陳偉健等［16］在研究氨化處理稻草的體外發酵特性時發現，氨化處理能顯著增加反芻動物瘤胃內主要纖維降解菌產琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌的數量，從而產生大量纖維素酶和半纖維素酶來加速底物水解增加還原糖生成量，最終大幅提高VFA產量［17］。氨化通過破壞木質素與多糖間的酯鍵，并與多糖形成銨鹽，成為瘤胃內微生物合成菌體蛋白的氮源。同時，氨化處理通過添加外源氮的方式提高了稻草的含氮量，導致微生物發酵產生較高的NH3-N，同時改善了MCP的合成效率。

3.2 稻草發酵特性的動態變化

從稻草體外發酵動態變化看，瘤胃微生物在降解可消化養分的同時，伴隨著產氣量的增加、底物消失率的上升及VFA濃度的升高。由于發酵產生的VFA不能被及時消耗而累積造成p H持續下降。統計結果還顯示，各處理組96 h累計產氣量與其對應的DMD和VFA濃度呈顯著正相關，相關系數分別為0.911和0.972；與p H呈顯著負相關，相關系數為0.856。

瘤胃液中NH3-N和MCP濃度反映出日糧蛋白質降解與微生物蛋白合成間的動態平衡。本研究中，各處理組NH3-N變化趨勢為升高－降低－升高，而MCP則呈先升高后降低的趨勢，二者同時在發酵48 h時達到最高。飼料蛋白質中的易降解組分在培養初期能夠迅速發酵，所以在發酵前48 h NH3-N和MCP濃度均有所升高；隨著發酵時間延長，由于VFA等產物積累引起p H下降，從而影響微生物生長和對底物的降解，因此發酵后期NH3-N和MCP濃度有所降低。發酵液中NH3-N濃度在發酵后期呈先下降后升高的趨勢，可能是細菌溶菌、纖毛蟲自溶或纖毛蟲的吞噬作用釋放出氨所致。

4 結論

化學處理提高了稻草體外發酵累計產氣量、干物質消失率以及揮發性脂肪酸濃度，其中堿化處理效果最好。