馬鈴薯貯藏期主要病害拮抗內生細菌的篩選、鑒定及功能評價

王穎，王玉琴，楊成德，姚玉玲，陳秀蓉，薛莉

（甘肅農業大學草業學院 草業生態系統教育部重點實驗室 甘肅省草業工程實驗室 中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州730070）

我國是世界第二大草地資源國家，擁有天然草地近432 hm2，而在各類草地中，高寒草甸類草地面積最大，占全國草地總面積的17.77%；線葉嵩草（Kobresia capillifolia）是高寒草甸類草地的優勢牧草之一［1］，其大量的內生細菌是挖掘優良生物學功能菌株的微生物資源庫。隨著生態農業和綠色食品生產的興起和發展，作物病蟲害的生物防治越來越受到人們的重視。已從小麥（Triticum aestivum）［2-3］、水稻（Oryza sativa）［4］、馬鈴薯（Solanum tuberosum）［5］、番茄（Lycopersicon esculentum）［6］、柑橘（Citrus reticulata）［7］、煙草（Nicotiana tabacum）［8］、大豆（Glycine max）［9］、棉花（Gossypium）［10］和油茶（Camellia oleifera）［11］等植物中分離得到拮抗內生細菌。拮抗內生細菌防治范圍廣，對細菌病害、真菌病害和線蟲病害都有一定的作用，因此，內生細菌作為一種生防資源，已成為近年來生防菌劑研制開發的熱點［12-13］。不少學者對內生細菌的生物學功能進行了深入研究，發現內生細菌不僅可以通過產生植物生長素、赤霉素及細胞激動素等植物促生物質［14］來促進植物生長，而且可以通過溶磷作用［15-16］和固氮作用［17-18］轉化無效營養為有效營養，刺激和調控植物生長，增強植物抗病和抗逆能力等。因此，開發應用內生細菌資源不僅能解決化學農藥和肥料帶來的諸多問題，還能保持農田微生態系統多樣性，維持農田生態平衡，提高作物產量，實現農業的可持續發展。

馬鈴薯壞疽病（Phoma foveata）、炭疽?。–olletotrichum coccodes）和枯萎?。‵usarium avenaceum）是甘肅省馬鈴薯貯藏期最主要的病害，在重病區引起的爛薯率在30%以上［19-21］。因此，本研究以東祁連山高寒草地線葉嵩草內生細菌為對象，以馬鈴薯貯藏期壞疽病菌、炭疽病菌和枯萎病菌為指示菌進行了篩選，對拮抗細菌的分泌IAA、溶磷和固氮等能力進行了評價，并對其進行16S r DNA序列鑒定，以期為線葉嵩草生防內生細菌的利用與開發提供理論依據，也為馬鈴薯貯藏期病害生物防治提供優質菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試拮抗細菌 2012年7月分離自東祁連山高寒草地線葉嵩草中的44株內生細菌，現保存于甘肅農業大學草業學院微生物多樣性實驗室。

1.1.2 供試病原真菌 馬鈴薯炭疽病菌、馬鈴薯枯萎病菌和馬鈴薯壞疽病菌，由甘肅農業大學草業學院植物病理實驗室提供。

1.1.3 供試培養基 NA培養基、LB培養液、PDA培養基和金氏培養基按文獻［22］配制；PKO培養基、蒙金娜培養基［23］和阿須貝無氮培養基［24］分別按文獻的方法配制。

1.2 拮抗能力的測定

1.2.1 拮抗內生細菌的篩選 采用平皿對峙法測定抑菌效果。將病原真菌（馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯壞疽病菌）打成直徑為6 mm的菌餅，接在PDA培養基中央，將內生細菌點接在距菌餅2.5 cm處，每皿接4點，以只接病原真菌為對照，3個重復，置于25℃恒溫下培養8 d，測量抑菌帶并計算抑菌率，對拮抗能力強的菌株進行以下試驗。

1.2.2 對病原菌菌絲生長的影響 采用平板對峙法于接種后8 d觀察病原菌菌絲形態并顯微照相。

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 培養性狀和形態特征 將拮抗內生菌于NA平板劃單菌落，28℃下培養3 d后觀察并描述單菌落培養性狀；在NA平板上培養18～24 h后進行革蘭氏染色、測量菌體大小并顯微照相。

1.3.2 16S r DNA序列鑒定 按上海生工提供的試劑盒（Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒，批號：82561202）提取DNA并檢測，對具有特異性DNA條帶的提取物進行PCR擴增。擴增使用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。擴增條件為：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，48℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環；最后在72℃下延伸8 min，終止反應。反應體系：10×buffer（不含 MgCl2）5μL，MgCl2（25 mmol／L）3μL，d NTP（2.5 mmol／L）1μL，引物27F（10μmol／L）1 μL，引物1492R（10μmol／L）1μL，Taq酶 （2 U／μL）0.5μL，Target DNA（10 ng／μL）1.2μL，dd H2O定容至50μL。經檢測具特異性條帶的擴增產物送上海生工測序，所測序列與GenBank數據庫中序列進行同源性對比，采用Clustal 1.8軟件和Mega 4.0軟件構建系統發育樹，確定菌株的系統發育學地位。

1.4 固氮、溶磷、產IAA能力的測定

1.4.1 產IAA能力的定性測定 采用Salkowski比色法［25］。將100μL菌懸液分別接到含100 mg／L色氨酸和不含色氨酸的金氏培養液中，設置3個重復，以加等量無菌水的培養液為空白對照，于28℃、120 r／min恒溫振蕩培養12 d，后分別取50μL加入等量比色液（PC比色液或S2比色液），室溫靜置15 min后，觀察顯色反應，3個重復均變紅色表示能分泌IAA，否則不分泌IAA，顏色越深表示分泌數量越多。

1.4.2 產IAA能力的定量測定 采用純3-IAA 制作標準曲線。配制2組濃度依次為2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5 mg／L和25，50，75，100，125，150，175 mg／L的標準溶液，分別取4 m L，第1組中加等量PC比色液，另1組中加等量S2比色液，設置3個重復，黑暗靜置30 min后測定其OD530值并制作標準曲線。將培養12 d的菌懸液和空白對照10000 r／min離心10 min，取上清液4 m L分別加入等量比色液，黑暗靜置30 min后測定OD530值，以只加比色液為空白對照。根據標準曲線計算菌株分泌IAA的量，并按照PC比色液和S2比色液的測定范圍最終確定結果［26］。

1.4.3 溶磷能力的定性測定 將263XY1分別點接于PKO和蒙金娜平板培養基上，每皿4個接菌點，重復3次，28℃恒溫培養7 d后，觀察并測量菌株在培養基平板上形成的溶磷圈大小。根據溶磷圈直徑／菌落直徑（D／d值）確定內生菌的溶磷能力。比值越大，表示溶磷能力越強。

1.4.4 溶磷能力的定量測定 將1 m L 263XY1菌懸液接于PKO和蒙金娜培養液中，裝液量為50／150 m L，以接入等量無菌水的培養液為對照，重復3次。28℃、160 r／min恒溫振蕩培養10 d后10000 r／min離心15 min，上清液采用鉬銻抗比色法測定有效磷增量［27］。計算公式如下：

式中，P為有效磷增量；K為標準曲線查得顯色液的磷含量（mg／L）；V為顯色時溶液定容的體積（m L）；V1為顯色時吸取上清液的體積（m L）。1.4.5 固氮能力的定性測定 將263XY1點接于阿須貝無氮平板培養基上，每皿4個接菌點，重復3次，28℃恒溫培養；同時將200μL菌懸液接于阿須貝液體培養基中，重復3次，以接種等量無菌水為對照，28℃恒溫振蕩培養，于第3，5，7天觀察其生長狀況，若菌株能夠在平板培養基上明顯生長且能使液體培養基變渾濁則具有固氮能力。

1.5 統計分析

運用Excel 2007和SPSS 17.0統計分析軟件進行試驗數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗能力測定

2.1.1 拮抗菌株篩選 從44株內生細菌中篩選得到7株具拮抗作用的內生細菌，編號分別為262XY1、262XY2′、262XY3、263XY1、263XG5、263XG6和 263XG8，其 中 263XG5、263XG6 和263XG8分離自線葉嵩草根部，262XY1、262XY2′、262XY3和263XY1分離自莖部。263XY1與馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯壞疽病菌對峙培養，具明顯的抑菌帶（圖1），抑菌率分別為67.17%，86.24%和70.89%（表1），其抑菌能力顯著高于其他6株拮抗細菌（P＜0.05），因此對該菌株進行了以下試驗。

表1 內生細菌的抑菌能力測定Table 1 Inhibition rate of endophytic bacterium on pathogenic fungi

2.1.2 對病原菌菌絲生長的影響 病原菌菌落生長受抑制后，菌落邊緣和抑菌帶接觸部位的菌絲生長緩慢。鏡檢發現，受抑制菌絲的生長端分支增多，菌絲頂端、中部膨大呈泡狀，有明顯的畸形，部分前端膨脹破裂，內含物外溢（圖2），說明263XY1可使病原菌菌絲發生畸形變化從而影響菌絲正常生長。

圖1 263XY1對3種病原真菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effects of 263XY1 on 3 species of fungus pathogensA：枯萎病菌對照和處理Normal and inhibit of F.avenaceum；B：炭疽病菌對照和處理Normal and inhibit of C.coccodes；C：壞疽病菌對照和處理Normal and inhibit of P.foveata；下同The same below.

圖2 263XY1對病原菌菌絲的影響Fig.2 The influence of 263XY1 against hyphoae of pathogenic fungi

2.2 263XY1菌株的鑒定

2.2.1 形態觀察 263XY1革蘭氏染色陽性（圖3A），菌體大小為0.36～0.85μm×0.69～1.87μm。在NA平板培養基上菌落大小為3～4 mm，不規則形，邊緣不整齊，呈波狀，表面褶皺，較干燥，不透明，米白色（圖3B）。

2.2.2 16S r DNA序列鑒定 提取的263XY1基因組經16S r DNA引物擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，在近1500 bp處有一清晰的PCR特異性條帶 （圖4），經上海生工測序得16S r DNA基因序列長度為1451 bp，使用BLAST程序對所得序列在Genebank中進行同源性比較，263XY1與已報道的Bacillus vallismortis（JQ765433.1），Bacillussubtilis（FJ763648.1），Bacillussubtilis（JF926531.1）和Bacillus amyloliquefaciens（JF899260.1）等多個基因序列的同源性在99%以上，應用Clustal 1.8和Mega 4.0軟件進行多重序列比較后鄰接法構建系統發育樹，表明263XY1與B.vallismortis相似性最高（圖5），因此將其鑒定為Bacillus vallismortis（KF818642）。

圖3 263XY1革蘭氏染色（A）與單菌落（B）Fig.3 Gram staining（A）and a single colony（B）of 263XY1

圖4 263XY1的16S r DNA電泳圖Fig.4 16S r DNA PCR electrophoresis map of 263XY1（1，2：263XY1；3：標記 Marker）

圖5 263XY1的16S r DNA系統發育樹Fig.5 16S r DNA phylogenetic tree of 263XY1

圖6 263XY1比色反應Fig.6 263XY1 colorimetric reaction

2.3 生物學功能測定

2.3.1 產IAA能力的定性測定 與CK相比，加入不含色氨酸（Trp）的King菌懸液和含色氨酸的King菌懸液均有顯色反應，呈淡粉色（圖6），說明263XY1可以分泌IAA。

2.3.2 產IAA能力的定量測定 263XY1經連續培養12 d后，測定OD530值，結果表明，不含色氨酸時其分泌IAA的濃度為1.52 mg／L；含100 mg／L色氨酸的金氏培養液中其分泌IAA的濃度為3.31 mg／L，是前者的2倍，說明色氨酸的存在能增加263XY1合成IAA的量，即外源色氨酸可以作為263XY1合成IAA的前體物質。

圖7 263XY1在蒙金娜（A）和PKO（B）平板培養基上形成的溶磷圈Fig.7 Halo of phosphate-solubilization microorganism 263XY1 Mongina（A）and PKO（B）solid medium

2.3.3 溶磷能力的定性測定 263XY1在蒙金娜培養基上溶磷圈不明顯（圖7A），D／d值為1.10；但在PKO培養基上溶磷圈明顯（圖7B），D／d值為2.10，說明對無機磷有明顯溶磷能力，而對有機磷的溶解能力較差。

2.3.4 溶磷能力的定量測定 263XY1在PKO和蒙金娜液體培養基培養10 d后，有效磷增量分別為38.94和0.11 mg／L，說明263XY1對無機磷有較強的溶磷能力，但對有機磷溶磷能力差。

2.3.5 固氮能力的定性測定 263XY1點接于阿須貝平板培養基后，在第3天時形成菌落；接種于阿須貝液體培養基，7 d后培養液變渾濁，說明262XY1有固氮能力。

3 結論與討論

近年來，草地退化問題嚴重，在草地的生產中，應及時采取措施，才可逆轉草地的退化進程，實現草地的可持續利用。恢復退化的草地已成為亟待解決的問題，而養分供給能力是成功恢復退化草地主要依賴的因素之一［28-30］。開發具有拮抗作用等多功能的牧草內生細菌應用于草地，一方面可以補充草地自身養分，協調草地資源利用中生產功能與生態功能的沖突；另一方面也可以應用于農作物病蟲害的生物防治中。本研究以東祁連山高寒草地線葉嵩草中分離的內生細菌263XY1為對象，經16S r DNA序列鑒定為芽孢桿菌屬的細菌。目前，在國內外內生細菌多樣性研究的報道中，認為芽孢桿菌作為優勢菌種［31-32］，具有開發成為生物農藥和生物肥料的潛力，且效果顯著［33-34］，有進一步開發利用的價值。

內生細菌通過釋放土壤中不溶性的磷元素，促進植物生長和次級代謝物積累已有報道［15，16］。263XY1在PKO含無機磷培養基中的有效磷增量為38.94 mg／L，說明263XY1有較好溶解無機磷的能力，即具有較好促生作用，但是其溶磷機制有待進一步研究。周佳寧等［35］從茅蒼術（Rhizoma areactylodis）葉片中分離得到45株內生細菌研究其促生潛力，其中43株能夠分泌IAA，其濃度在22～268 mg／L，說明內生細菌可以分泌IAA促進宿主生長和抗逆；張英等［36］研究4株牧草根際促生細菌互作效應中發現，其分泌IAA量為0.212～9.33 mg／L，低于單株263XY1分泌的IAA量，263XY1與其他菌株復配時產生IAA的能力可能更強，但還有待進一步研究。263XY1分離自高寒草地線葉嵩草，其生存的極端環境可能有利于內生細菌在逆境中適應力的提高，如拮抗或增加IAA的分泌量等，發揮更好的促生作用［37］。另外，高寒的生存環境與馬鈴薯在貯藏期所需要的低溫條件正好吻合，更加適合于開發為防治馬鈴薯貯藏期病害的生物農藥。

目前報道的具生物學功能的內生細菌較多，但同時具備多種功能于一體的內生細菌并不多。263XY1為G＋，經16S r DNA序列分析將其鑒定為死谷芽孢桿菌，對馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯壞疽病菌均具有較強拮抗作用，抑菌率分別達到67.17%，86.17%和70.89%，且還具有較強溶磷、產生IAA和固氮能力，是一株多功能拮抗內生細菌。因此，該菌株有進一步開發為防治馬鈴薯貯藏期病害的微生物產品的巨大潛力。