大蒜素對辣椒炭疽病和辣椒疫病病菌的室內抑制活性測定及田間防效研究

周清，李保同，湯麗梅

（江西農業大學農學院，江西 南昌330045）

辣椒炭疽病（Colletotrichum capsici）和辣椒疫病（Phytophthora capsici）是辣椒（Capsicum annuum）生長過程中發生普遍且危害嚴重的世界性病害。辣椒炭疽病病原菌可通過種子、土壤和病株殘體侵染，引起辣椒落葉、爛果和幼苗死亡，對辣椒的產量、品質和貯藏產生很大的影響［1］。辣椒疫病是一種毀滅性土傳卵菌病害，其病原菌可侵染辣椒、茄子（Solanum melongena）、番茄（Lycopersicon esculentum）、黃瓜（Cucumis sativus）等作物，危害辣椒的根、莖、葉和果實等部位，在氣候條件適宜的情況下，短期內就可爆發蔓延，給辣椒生產造成嚴重經濟損失［1］。目前，化學防治仍是辣椒炭疽病和辣椒疫病的主要防治措施，這不僅易造成蔬菜和環境污染，還易誘發病原菌的抗藥性［2-5］。為尋求安全有效的防治措施，利用生物農藥防治辣椒病害，減少農藥殘留，提高農產品質量安全，越來越引起人們的關注。植物是生物活性化合物的天然寶庫，各類植物中含有數以萬計的次生代謝產物，其中生物堿類、萜烯類、黃酮類、檸檬素和番荔枝內酯等化合物都具有較強的抑菌活性［6-7］。已有文獻報道，金銀花（Lonicera japonica）、板藍根（Isatis tinctoria）、黃芩（Scutellaria baicalensis）、苦參（Sophoraflavescens）、丁香（Syzygium aromaticum）、烏梅（Prunus mume）、百部（Stemona sessilifolia）、桂枝（Cinnamomum cassia）等植物提取物以及枯茗酸、茶皂素、小蘗堿、芳樟醇、香茅醛等植物次生代謝產物對辣椒炭疽病和疫病菌具有良好的抑制活性和田間防治效果［8-13］。

大蒜素（allicin）又名大蒜新素，化學名稱為二烯丙基三硫化物（CH2＝CH－CH2－S－S－S－CH2－CH＝CH2），是從蒜（Allium sativum）的球形鱗莖中提取的揮發性油狀物，被譽為天然廣譜抗生素，已廣泛用于抑制金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）、福氏痢疾桿菌（Shigella flexne-ri）、宋氏痢疾桿菌（Shigella sonnei）、傷寒桿菌（Salmonella enterica）、大腸桿菌（Escherichia coli）等病菌和心血管等疾病的防治［14-16］。關于大蒜素在作物上的應用研究，孫惠敏等［17］報道大蒜素對柑橘潰瘍病病原細菌（Xanthomonas cam pestris）的抑制活性，有研究［18-20］報道大蒜素對棉花致病菌立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、棉花串珠鐮孢菌（Fusarium moniliforme）、棉花尖鐮孢萎蔫專化型真菌（Fusarium oxysporum）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、番茄葉霉病菌（Fulvia fulva）和番茄早疫病菌（Alternaria solani）等病原真菌抑制效果，由此證實大蒜素具有抑制植物病原細菌和真菌廣譜的特性。而有關大蒜素對辣椒炭疽病菌和辣椒疫病菌的抑制作用報道較少。本文研究了大蒜素對辣椒炭疽病菌和辣椒疫病菌菌絲生長、孢子產生和孢子萌發的抑制作用及其田間防治效果，以期為大蒜素在蔬菜上的開發應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

藥劑：98%大蒜素精油，由陜西慈緣生物技術有限公司生產，溶于甲醇配制成12 mg／m L的母液；加復合氨基酸、月桂酸甲酯、乳化劑Termul 5030、乙二醇和去離子水等助劑，配制成6%大蒜素水乳劑；98%多菌靈（carbendazim）原藥由山東華陽科技股份有限公司生產，溶于甲醇配制成10 mg／m L的母液；50%多菌靈可濕性粉劑由江陰市福達農化有限公司生產。

儀器：電子天平（感量0.1 mg）、光照培養箱、移液槍、卡尺、錐形瓶、玻璃棒、培養皿（Ф＝90 mm）、打孔器（Ф＝6 mm）、接種器、血球計數板、凹玻片、載玻片等。

菌株：辣椒炭疽病菌和辣椒疫病菌由江西農業大學農學院植物病理實驗室提供，經轉接、純化培養后供試。

培養基：馬鈴薯培養基（PDA），稱取200 g馬鈴薯置于1000 m L蒸餾水中，煮沸30 min，過濾，加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂，融化后用蒸餾水補足至1000 m L，分裝滅菌（126℃，25 min），備用。玉米粉培養基（CMA）：稱取玉米粉300 g置于1000 m L蒸餾水中，60℃水浴加熱1 h，過濾，加入16 g瓊脂，用蒸餾水補足至1000 m L，分裝滅菌（126℃，25 min），備用。

1.2 方法

1.2.1 藥劑對病原菌菌絲生長的影響 在預備試驗的基礎上，選擇各藥劑對病原菌菌絲生長抑制率在10%～90%范圍內的5個濃度，用甲醇將藥劑配成一定濃度的母液，按照體積比1∶100的比例分別加入到已融化并冷卻至50℃左右的PDA培養基中，充分混勻后分別倒入4個滅菌的培養皿內，制成系列濃度的含藥培養基（即大蒜素50.0，66.7，100.0，200.0，600.0μg／m L，多菌靈1000μg／m L），以加入等體積甲醇的 PDA 平板為對照［21-22］。用打孔器截取在PDA培養基上培養的待用病原菌菌餅，菌絲面朝上接種于已凝固的含藥PDA培養基中央，置于25℃下黑暗培養，待對照菌落直徑長至大于平皿直徑2／3時，用卡尺測量菌落直徑（mm）。每個菌落用十字交叉法垂直測量直徑各1次，取其平均值。每處理重復3次，與對照比較計算各藥劑處理對菌落擴展的生長抑制率，分析比較供試藥劑對供試病原菌菌絲生長的影響。以藥劑濃度的對數值為橫坐標，菌絲生長抑制率的幾率值為縱坐標，采用回歸分析法對試驗數據進行分析，計算各處理的EC50值、EC90值及其95%置信限。

1.2.2 藥劑對病原菌孢子產生的影響 用打孔器截取在PDA培養基上培養的待用病原菌菌餅，菌絲面朝上接種于已凝固的含藥PDA（炭疽病菌培養）或CMA（疫病菌培養）培養基中央，以無藥劑的培養基為對照。接種的PDA培養基于30℃下連續光照培養7 d后，加入40 m L無菌水，用毛筆刷洗培養基表面的孢子，過濾。接種的CMA培養基于26℃下黑暗培養3 d后，繼續光照培養6 d，在培養基中加入40 m L無菌水于16℃下再光照培養0.5 h后，用毛筆刷洗培養基表面的孢子，過濾。用血球計數板在10×10倍視野下鏡檢孢子的數量，每菌餅隨機檢測4視野。每處理重復3次，與對照比較計算各藥劑對孢子產生的抑制率，分析供試藥劑對供試病原菌孢子產生的影響。

1.2.3 藥劑對病原菌孢子萌發的影響 按1.2.2無藥劑對照操作方法產生的孢子，用滅菌水稀釋至1×105～1×107個孢子／m L，并加入0.5%葡萄糖溶液，備用。在無菌條件下將6%大蒜素水乳劑用無菌水配成一定濃度的母液，用移液槍從低濃度到高濃度依次吸取0.5 m L母液分別加入小試管中，再吸取制備好的孢子懸浮液0.5 m L使藥液與孢子懸浮液等量混合均勻，配置成試驗所需濃度。用微量加樣器吸取藥劑孢子混合液滴至凹玻片上，將凹玻片架放于帶有淺層水的培養皿中，于25℃下光照靜置2 h。每處理重復3次，并設不含藥劑的處理作對照。當對照孢子萌發率達到90%以上時，在10×10倍視野下鏡檢孢子萌發的情況，孢子芽管長度大于孢子的半徑視為萌發。每處理隨機觀察4個視野，記錄孢子總數和萌發孢子數。每處理重復3次，與對照比較計算各藥劑對孢子萌發的抑制率，分析供試藥劑對供試病原菌孢子萌發的影響。

1.2.4 藥劑對辣椒炭疽病和疫病的田間防治效果 試驗于2011年在江西農業大學科技園保護地辣椒上進行，土壤有機質含量2.15%，p H值5.8，肥力中等。供試辣椒品種為湘研19號，2月12日定植，株行距40 cm×60 cm。試驗設6%大蒜素水乳劑66.7，100.0，200.0，600.0，1200.0μg／m L，50%多菌靈可濕性粉劑1000μg／m L和清水對照，共7個處理，3次重復，隨機區組排列，小區面積20 m2。于辣椒苗期，即3月7，17，27日連續噴藥3次防治疫病；于辣椒掛果期，即5月9，19，29日連續噴藥3次防治炭疽病，藥液用量450 kg／hm2。第1次施藥前調查病情基數，最后1次藥后3，7，14 d分別調查1次病害的防治效果。病情調查、分級標準及藥效計算參照《農藥田間藥效試驗準則》（一）有關方法進行［23］，用Duncan氏方法對數據進行方差分析，比較各處理間的差異。

辣椒果實炭疽病病情分級標準：0級，無病斑；1級，病斑面積占果實面積的2%以下；3級，病斑面積占果實面積的3%～8%；5級，病斑面積占果實面積的9%～15%；7級，病斑面積占果實面積的16%～25%；9級：病斑面積占果實面積的25%以上。

辣椒植株疫病病情分級標準：0級，無癥狀；1級，地上部僅葉、果有病斑；3級，地上莖、枝有褐腐斑；5級，莖基部有褐腐斑；7級，地上莖、枝與莖基部均有褐腐斑，且部分枝條枯死；9級，全株枯死。

2 結果與分析

2.1 藥劑對病原菌的抑制作用

2.1.1 對病原菌菌絲生長的抑制作用 大蒜素在供試濃度內對辣椒炭疽病菌和疫病菌菌絲生長有顯著的抑制作用，其抑制活性與濃度呈正相關，200～600μg／m L處理對炭疽病菌菌絲生長的抑制效果為71.17%～78.06%，與對照藥劑多菌靈1000μg／m L處理無顯著差異，對疫病菌絲生長的抑制效果為71.39%～78.23%，顯著低于對照藥劑多菌靈1000μg／m L處理（表1）。大蒜素對炭疽病菌和疫病菌菌絲生長的抑制中濃度（EC50）分別為130.15和128.11μg／m L，EC90值分別為992.26和988.74μg／m L（表2）。

2.1.2 對病原菌產孢及孢子萌發的抑制作用 不同濃度的大蒜素（50～600μg／m L）均對辣椒炭疽病菌和疫病菌產孢和孢子萌發均有顯著的抑制作用，其抑制活性與濃度呈正相關，600μg／m L處理對炭疽病菌產孢的抑制效果為81.16%，顯著高于對照藥劑多菌靈1000μg／m L處理，對炭疽病菌孢子萌發的抑制效果為83.72%，與對照藥劑無顯著差異；600μg／m L處理對疫病菌產孢的抑制效果為88.23%，顯著低于對照藥劑多菌靈1000 μg／m L處理，對疫病菌孢子萌發的抑制效果為84.40%，顯著高于對照藥劑（表1）。大蒜素對炭疽病菌產孢和孢子萌發EC50值分別為142.60和127.21μg／m L，EC90值分別為936.20和836.82μg／m L，對疫病菌產孢和孢子萌發EC50值分別為123.64和139.68μg／m L，EC90值分別為450.01和729.05μg／m L（表2）。

表1 大蒜素對辣椒炭疽病菌和疫病病原菌的抑制效果Table 1 Inhibitive effects of allicin on pathogenic fungi of C.capsici and P.capsici

表2 大蒜素對辣椒炭疽病和辣椒疫病病菌的室內毒力測定結果Table 2 Toxicity efficiency of allicin on pathogenic fungi of C.capsici and P.capsici in the greenhouse

2.2 大田防治試驗

2.2.1 大蒜素對辣椒炭疽病防效 大蒜素對辣椒炭疽病具有良好的防治效果，600～1200μg／m L處理第3次藥后3，7，14 d對辣椒炭疽病的防效為83.54%～88.25%，82.01%～86.17%和74.59%～79.16%，與對照藥劑50%多菌靈可濕性粉劑1000μg／m L處理無顯著差異；66.7～200.0μg／m L處理第3次藥后3～14 d對辣椒炭疽病的防效均低于76%，極顯著低于對照藥劑50%多菌靈可濕性粉劑1000μg／m L處理（表3）。

2.2.2 大蒜素對辣椒疫病防效 大蒜素對辣椒疫病具有良好的防治效果，600～1200μg／m L處理第3次藥后3，7，14 d對辣椒疫病的防效分別為82.85%～85.88%，79.91%～83.37%和74.59%～78.01%，與對照藥劑50%多菌靈可濕性粉劑1000μg／m L處理無顯著差異；66.7～200.0μg／m L處理藥后3～14 d對辣椒疫病的防效均低于76%，極顯著低于對照藥劑50%多菌靈可濕性粉劑1000μg／m L處理（表4）。

表3 大蒜素對辣椒炭疽病的田間防治效果Table 3 Field efficacy of allicin on C.capsici

表4 大蒜素對辣椒疫病的田間防治效果Table 4 Field efficacy of allicin on P.capsici

3 結論與討論

通過室內抑菌活性測定表明，大蒜素可有效抑制辣椒炭疽病菌和辣椒疫病菌菌絲生長、孢子產生和孢子萌發，其EC50值均在142.60μg／m L以下，EC90值均在1159.66μg／m L以下；通過田間試驗表明，6%大蒜素水乳劑對辣椒炭疽病和辣椒疫病具有較好的防治效果，600～1200μg／m L處理第3次藥后3 d防效均在82.85%以上，第3次藥后14 d防效均在74.59%以上。因此，6%大蒜素水乳劑具有在辣椒炭疽病和辣椒疫病防治上推廣應用的價值。用6%大蒜素水乳劑防治辣椒炭疽病和辣椒疫病的推薦使用劑量為600～1200μg／m L，建議在辣椒苗期和掛果期連續噴施3次，每隔10 d噴施1次。

辣椒炭疽病菌和辣椒疫病菌侵入植物體內的一般過程是分生孢子（疫病為卵孢子）通過風雨等傳播落在辣椒植株表面，在潮濕條件下萌發形成芽管和附著孢子侵入寄主組織，然后擴展形成菌絲發病［24］。本試驗通過室內研究發現，大蒜素對辣椒炭疽病菌和疫病菌菌絲生長、孢子產生和孢子萌發有抑制作用；田間試驗結果表明，大蒜素對辣椒炭疽病和疫病有較好的防治效果，并具有一定的持效期。這表明大蒜素對辣椒炭疽病菌和疫病菌的侵入和擴展均可能產生不同程度的影響。殺菌劑對病原菌的作用機制有多種，如抑制真菌細胞壁形成和質膜生物合成，抑制呼吸作用，抑制甾醇生物合成（SBI）及其合成過程中的脫甲基（DMI），增加線粒體膜和內質網膜上的脂質過氧化反應等［25］。大蒜素的生物活性主要來源于它與含巰基化合物的相互作用和抗氧化能力，其抗菌的機理可能是對乙酰輔酶A的抑制作用［26-27］。有關大蒜素的抑菌抗病機制有待進一步研究。

大蒜素對植物病原菌的抑制活性存在差異。宋興舜等［19］報道大蒜素原藥33～100μg／m L對番茄早疫病菌菌絲生長抑制率為28.70%～76.00%，72～143μg／m L對番茄葉霉病菌和番茄灰霉病菌菌絲生長的抑制率分別為34.12%～74.07%和51.77%～83.32%；蔣家珍等［18］報道5%大蒜素乳油對棉花立枯絲核菌、棉花串珠鐮孢菌和棉花尖鐮孢萎蔫專化型真菌菌絲生長EC50值分別為19.40，7.10和20.60μg／m L。本實驗發現大蒜素對辣椒炭疽病菌和辣椒疫病菌EC50值分別為130.15和128.11μg／m L，EC90值分別為992.26和1159.66μg／m L，這與前人報道的結果存在較大差異，其原因可能與供試的藥劑來源和靶標種類不同有關。在新鮮大蒜中沒有游離的大蒜素，其前體為蒜氨酸和蒜酶，自然狀況下獨立穩定地存在于鱗莖中。當大蒜經加工或受到物理機械破碎后，大蒜中被激活的蒜酶催化分解蒜氨酸，生成具有揮發性的大蒜素［28］。現代研究認為，大蒜素是具有生物活性的亞砜和砜類化合物成分的總稱，其主要成分為二烯丙基三硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫酸、二烯丙基硫代亞磺酸酯和甲基烯丙基三硫醚［28］。曾東方等［20］報道大蒜乙醇萃取物20000μg／m L對稻瘟病菌、小麥紋枯病菌、油菜菌核病菌菌絲生長的抑制效果分別達到70.60%，83.60%和94.30%，張萬萍和趙麗［29］報道大蒜水和乙酸乙酯提取物對辣椒疫病菌菌絲生長的最低抑菌濃度為5000μg／m L，與本試驗結果比較活性明顯偏低，其原因可能是大蒜提取物中活性成分含量偏低所致。