塔克拉瑪干沙漠生物結皮中幾種藻類的系統發育分析

王丹，龔春霞，茍亞峰，周路，朱軍保，高劍峰

（石河子大學生命科學學院，新疆 石河子832000）

據統計，2011年中國北方沙漠化土地達37.59萬km2，其中輕度沙漠化土地占33.80%，中度沙漠化土地占22.84%，重度沙漠化土地占22.16%，嚴重沙漠化土地面積占21.21%，沙漠化已成為人類所面臨的嚴重的環境問題之一［1］。在沙漠化修復的研究中，現階段固沙的主要生物技術方法為防風林及草帶的建立［2］，與此同時微生物在沙漠化治理的研究中也得到了初步探討。潘惠霞等［3］在新疆古爾班通古特沙漠的結皮中分離到了一株寡營養細菌，該菌株可產生大量胞外粘多糖，將該菌株的培養液噴灑到流沙表面后，可形成6 mm厚的粘合性的沙層。鄒碧瑩和張元翼［4］在地中海沙漠化生態系統的研究中發現，植物種子萌發期加入叢枝菌根真菌與固氮根瘤菌不僅能協助植被在沙漠化區域的建立，同時還可以增加土壤肥力與質量。盡管沙漠化區域微生物的研究展示了一定的應用潛力，而相對于沙漠化區域的大面積分布，對沙漠化生態系統中微生物的研究還處于起步階段［5-8］。

生物結皮通常是由各種光合及非光合生物組成的，包括藍藻、地衣、綠藻、苔蘚、真菌及一些微小原生動物。這些棲居在土壤表層的生物往往生活在極端惡劣的氣候環境條件下。例如位于新疆準噶爾盆地腹地的古爾班通古特沙漠年平均降水量不超過150 mm，在沙漠腹地僅有70～100 mm，年均溫為6～10℃，極端溫度為40℃以上，均有結皮生物［9-10］。Evans和Ratledge［11］一致認為結皮生物群落在沙漠中對固定土壤和養分循環發揮著重要的作用。

目前，李芳芳等［12］用18S r RNA基因對古爾班通古特沙漠分離的綠藻進行了系統學研究，趙建成等［9］對該沙漠生物結皮進行了研究，結果表明，該沙漠中有很多常見的單細胞綠藻，例如小球藻、膠球藻、鏈帶藻和衣藻等。Lewis和Lewis［13］的研究結果表明在結皮生物中的綠藻主要包含三大類群，綠藻綱、共球藻綱和輪藻綱。

塔克拉瑪干沙漠是世界第二大流動沙漠，研究其生物結皮及微生物組成顯得尤為重要，因為沙漠化嚴重威脅塔克拉瑪干沙漠南緣和北緣的綠洲農業發展。圍繞塔克拉瑪干沙漠生態環境已經有很多學者進行了有關研究報道，但主要集中在沙危害分異規律、沙漠腹地人工綠地、沙漠自然植被光合特性、耗水量、根生態以及土壤種子庫的研究等方面［2-7］，而關于微生物的研究僅見關于其數量在結皮中的分布研究［13］，特別是結合分子生物學方法對微生物群落結構特征的研究更為少見。張丙昌等［14］對古爾班通古特沙漠中綠藻的區系組成、生態分布特點和結皮不同發育階段綠藻種類組成的動態變化進行了研究，李芳芳等［12］運用分子生物學18S r RNA基因對古爾班通古特沙漠分離的綠藻進行了系統學研究。本研究運用形態學和分子生物學相結合的方法對塔克拉瑪干沙漠生物結皮中幾種藻類進行研究，擬建立一個適合分離純化和鑒定沙漠微藻的方法，為后續塔克拉瑪干沙漠微藻的研究工作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 自然概況

中國新疆塔里木盆地中央的塔克拉瑪干沙漠，氣候屬于典型的大陸性暖溫帶干旱荒漠氣候，年平均氣溫9～11.2℃，最熱月份8月的極端最高氣溫為43.2℃，最冷月份1月的極端最低氣溫為－19.3℃，年降水量60～80 mm，年內分配不均衡，多集中在春、夏兩季，且年際變率大。沿著古爾班通古特沙漠公路附近采集沙樣（N 37°36.732′～N 40°47.377′，E 80°23.442′～E 84°17.638′），多流動沙丘上基本無植物生長，偶見沙米（Agriophyllum squarrosum）及花棒（Hedysarum scoparium），蓋度小于1%。

1.2 采樣

采樣時，用無藻鏟采集沙樣表層及其以下至10 cm深，收集于無菌密封袋。每次采樣后用70%酒精擦拭采樣工具，以防交叉污染。

本實驗藻種均分離自塔克拉瑪干沙漠采集沙樣的混合培養藻液。表1列出了2011年11月19日從塔克拉瑪干沙漠分離的6株微藻的沙樣采集地點。

1.3 沙漠微藻的混合培養、分離與純化

1.3.1 混合培養 稱取5 g采集的沙樣于滅菌的裝有30 m L培養液的50 m L三角瓶中，充分混勻，置于光照培養箱，光照強度為2500 lx，光暗周期為12 h／12 h，溫度為23℃的條件下培養1～2周，隨時觀察雜菌污染情況，如雜菌過多，則終止培養。

1.3.2 分離與純化 采用平板法和96孔板有限稀釋法分離純化上述混合培養的藻液。分離過程中定期鏡檢培養藻液，直到1000倍鏡下觀察的微藻形態一致即純化成功，然后將已純化成功的微藻進行逐級擴大培養。

表1 塔克拉瑪干沙漠采樣地的分布概況Table 1 Sampling locations of algae strains used in present study in the Taklimakan desert

1.4 分離純化微藻的分子鑒定

1.4.1 DNA提取 取對數生長期OD680的藻液400～600 m L，3000 r／min離心8 min，收集沉淀，用液氮研磨至粉末置于1.5 m L離心管中；用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒提取微藻基因組DNA。

1.4.2 序列擴增及測序 用于擴增綠藻的5.8S-ITS的引物序列為：上游5′-TTCTTAGTTGGTGGGTTGCCT-3′，下游5′-TTTCATCTTTCCCTCACGGTA-3′［15］。

用于擴增真核綠藻的18S r DNA的引物序列為：上游5′-ACCTGGTTGATCCTGCCAGTAG-3′，下游5′-ACCTTGTTACGACTTCTCCTTCCTCC-3′［16］。

用于擴增16S r DNA的原核生物通用引物序列為：上游5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′［17］。

PCR反應體系為20μL，dd H2O：12.4μL，Buffer：2.0μL，MgCl2：1.2μL，d NTP：1.2μL，引物1：1.0μL，引物2：1.0μL，DNA模板：1.0μL，Taq酶：0.2μL。PCR反應體系擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，60℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環；72℃延伸5 min，擴增結果用1%的瓊脂糖進行電泳檢測，凝膠成像系統記錄實驗結果。將PCR產物用TIANGEN普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后再用p MD18-T載體連接試劑盒（Ta KaRa）進行連接，轉入大腸桿菌DH5a，由北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。

1.5 系統發育分析

將測得序列提交至GeneBank，利用Blast搜索引擎中的nucleotide blast獲得所測序列的同源序列，用Gene-Doc軟件進行多序列對位分析，MEGA 4.1軟件進行序列分析，并采用鄰接法 （NJ）建樹，Kimu-ra 2-parameter計算遺傳距離值，重復1000次計算bootstrap值。

2 結果與分析

2.1 5株藻種的形態學特征

從塔克拉瑪干沙漠6個采樣地分離得到6株微藻。在光學顯微鏡100倍油鏡下觀察其細胞形態。其特征為TLD2A1單細胞球形，色素體杯狀，占細胞的一半或稍多，細胞直徑3～6μm。TLD2B細胞呈橢圓或卵形，兩端略為變尖，眼點位于細胞中部，細胞寬3～5μm，長7～9μm。TLD5A1植物體呈中空而薄的裂片狀，生長后期漂浮，呈褐色或深褐色，藻絲呈強烈卷曲或有時平行排列，細胞呈球形或近球形。TLD6B單細胞或幾個細胞聚在一起，呈球形，細胞壁薄，細胞直徑5～10μm。TLD7A-2游動的單細胞，細胞呈橢圓形，細胞寬8～12μm，長10～13μm。TLD7B-5單細胞，形態多呈月牙狀，細胞長3～9μm，寬2～4μm，兩頂端直線距離3～7μm。

根據其形態特征參照文獻［18］進行檢索分類，經鑒定表明TLD2A1、TLD6B的初步分類地位為綠藻門、綠藻綱、綠球藻目；TLD2B、TLD7A-2初步分類為綠藻門，綠藻綱，團藻目；TLD7B-5初步分類為綠藻門、綠藻綱；TLD5A-1初步分類為藍藻門（經石河子大學高劍峰教授加以鑒定）。

2.2 序列分析

2.2.1 5株綠藻的序列分析 依據形態觀察TLD2A1、TLD2B、TLD6B、TLD7A-2和TLD7B-5均為綠藻門，用18S r DNA保守區引物分別擴增了5株微藻的18S r DNA序列，其長度分別為1767，1759，1766，1764和2657 bp；TLD2A1、TLD7A-2、TLD7B-5三株藻5.8S r DNA-ITS的擴增產物長度分別為1539，1437，2428 bp，與NCBI已知的數據庫進行比較，根據比對同源性相近藻的18S r DNA全序列及普通小球藻（Chlorella vulgaris）（AB237642）r DNA序列，確定5.8S r DNA-ITS（包括ITS1、ITS2和5.8S r DNA區域）序列長度分別為650，564和672 bp。數據提交至GenBank。其中TLD7B-5的18S核糖體r DNA測序后發現其長度比另外2株綠藻長很多，將其在Blast比對后發現有2個內含子，去除內含子后與各序列于NCBI Blastn比對并進行核酸數據庫同源性分析（表2）。TLD2A1、TLD2B、TLD6B、TLD7A-2、TLD7B-5的18S r DNA序列G＋C含量分別為49.7%，49.5%，49.8%，48.0%和48.2%。

表2 6株沙漠微藻核酸序列與NCBI核酸數據庫同源性比對分析Table 2 Blast of the nucleotide sequence of 6 desert algae strains

2.2.2 16S r DNA序列分析 依據形態觀察TLD5A1為藍藻門，用16S r DNA引物序列擴增了TLD5A1的16S r DNA序列，長度為1481 bp。數據提交至GenBank，將測得序列與GenBank中7個序列及外類群集胞藻的16S r RNA基因序列進行排列對齊，排序后共有1443 bp位點，比較了TLD5A1的16S rDNA和GenBank中7個序列的堿基組成發現，TLD5A1的GC含量為54.7%，其他7個序列的G＋C含量均在53.9%～55.0%之間。其序列于NCBI Blastn比對并進行核酸數據庫同源性分析（表2）。

2.3 系統發育分析

2.3.1 綠藻系統發育分析 將分離藻株中5株綠藻的18S r DNA和其中3株的5.8S r DNA-ITS序列于Blast同源比對分析，下載與其同源性相對較高的序列5～9個，全部輸入GeneDoc軟件，比對后將序列開始和結尾長短不一的片段刪減整齊，比對結果輸入到MEGA 4.1軟件中，選取的核苷酸置換模型為Kimura雙參數模型（Kimura 2-parameter），自展支持分析重復1000次。得到的18S r DNA和5.8S r DNA的NJ樹（圖1和圖2）。

圖1 基于18S r DNA基因序列的鄰接樹Fig.1 NJ tree based on sequences of 18S rDNA gene節點處數字代表1000次重復自展分析所得到支持率（%）The numbers at the nodes represent bootstrap support of 1000 replicates（%）.下同The same below.

5株綠藻的18S r DNA系統發育樹分析表明，實驗所分離的5株綠藻可以分別在3個大分支內，其中1個類群可歸于小球藻科，以TLD2A1、TLD6B為代表，它們的18S r DNA序列與普通小球藻藻株的相似性最高，為99.89%。TLD2B和TLD7A-2分別與衣藻科的9個物種聚為一大分支，其中TLD2B與咸胞藻（Brachiomonas sp.）聚為一支相似性為98.16%，自展支持率為91%，TLD7A-2與Chlamydomonas sp聚為一支相似性為97.65%，自展支持率為72%，TLD7B-5的18S r DNA 與綠藻門，綠藻綱環藻目的Selenastraceae、柵藻科（Scenedesmaceae）、環藻目Sphaeropleales三科物種聚為一支，其中與綠球藻（Tetranephris brasiliensis）同源性最高為98.86%。

TLD2A1、TLD7A-2、TLD7B-5三株綠藻的5.8S r DNA-ITS系統發育分析，結合他們的18S r DNA數據表明，TLD2A1與Chlorella sp.為同一屬，TLD7A-2的5.8S r DNA-ITS與萊茵衣藻（Lobochlamys segnis）、衣藻（Chlamydomonas inflexa）、南極衣藻（Chlamy domonas sp.）聚為一支，與南極衣藻相似性最高為72.94%。TLD7B-5的5.8S r DNA-ITS與環藻目科（Selenastraceae）的月牙藻（Pseudokirchneriella sp.）聚為一支，相似性最高，為87.31%，自展支持率低于50%，這與其18S r DNA數據有些差異。

圖2 基于5.8S r DNA-ITS基因序列的鄰接樹Fig.2 NJ tree based on sequences of 5.8S rDNA-ITSgene

2.3.2 1株藍藻系統發育分析 將TLD5A1的16S r DNA序列于Blast同源比對分析，下載與其同源性相對較高的序列7個，全部輸入GeneDoc軟件，比對后將序列開始和結尾長短不一的片段刪減整齊，比對結果輸入到MEGA 4.1軟件中，選取的核苷酸置換模型為Kimura雙參數模型（Kimura 2-parameter），自展支持分析重復1000次，得到的16S r DNA的NJ樹見圖3。

圖3 基于16S r DNA-ITS基因序列的鄰接樹Fig.3 NJ tree based on sequences of 16S r DNA-ITSgene

它的16S r DNA序列與念珠藻科的物種聚為一支，其中與念珠藻屬的藍藻（Nostoc ellipsosporum）相似性最高，為97%，有37個堿基不同，NJ樹也與其聚為一支，自展支持率為60%。

3 討論

3.1 鑒定

塔克拉瑪干沙漠的藻類研究相關報道較少見，目前國內對藻類結皮的研究，主要為形態學鑒定，這種方法費時并且需要鑒定者有豐富的分類經驗，很多形態學特征會隨著生長環境和生長階段的改變而變化。隨著分子生物學技術的發展，5.8S r DNA、18S r DNA、16S r DNA等序列分析方法在物種鑒定中已經普遍使用［15-17］。本研究先采用傳統的形態鑒定，再結合現代分子生物學方法對分離藻株進行分析，這樣較大程度地保證了結果的準確性。本研究從塔克拉瑪干沙漠通過形態學和分子學鑒定分離得到了5株綠藻，其中3株隸屬于綠藻綱，2株為共球藻綱。在沙漠中的綠藻主要包含三大類群，綠藻綱、共球藻綱和輪藻綱［19-20］，因此推斷這些沙漠綠藻均起源于淡水藻，當然這有待更多實驗研究的驗證。

3.2 結論

依據文獻報道，97%～99%全序列相似的可判定為一個屬。形態學和18S r DNA數據結合分析表明，實驗分離的5株綠藻均鑒定到科，分別為衣藻科（TLD2B，TLD7A-2）、小球藻科（TLD2A1、TLD6B）、環藻科（TLD7B-5），5.8S rDNA-ITS序列進化速度快，變異豐富，適合種內鑒定，TLD2A1的5.8S r DNA與18S r DNA數據結果一致，與小球藻親緣關系最近，TLD7B-5的5.8S r DNA-ITS與18S結果有一定差異，可能是因為GenBank中物種序列不全所造成的。

5株綠藻的18S r DNA序列GC含量為48.0%～49.8%，包含在與它們同源的30個類群GC含量之間（48.0%～50.0%），差異為1.8%。同時對3株綠藻的5.8S r DNA-ITS序列的堿基構成進行分析，TLD2A1同其小球藻屬的物種比對發現GC含量均在57.1%～58.4%之間，差異不足1.4%。TLD7A-2的GC含量為44.2%，遠小于其他4個相近物種的GC含量（50.2%～52.0%），可能和TLD7B-5類似，由于數據庫中物種序列不完全所導致的。發現18S r DNA序列GC含量沒有明顯差異，而5.8S r DNA-ITS序列不同科屬之間的GC含量差異明顯，并且同一科屬其GC含量也可能有所不同（如TLD7A-2）。TLD5A1的GC含量為54.7%，Blast比對后與其同源性較高的其他7個序列的GC含量均在53.9%～55.0%之間，這與Li和Watanabe［21］檢測了50株純培養的魚腥藻的GC含量，并比較了依據GC含量分類與應用形態學、生理和生化分類的結果，得出相同物種的GC含量是相近的，但是具有相同GC含量的物種卻不一定有較近的親緣關系結果一致。