農業院?；A生化實驗方法的改進和探索——以“淀粉酶活力測定”實驗為例

易曉華YI Xiao-hua

（青島農業大學生命科學學院，青島266109）

0 引言

基礎生化實驗是農業院校中為農學、園藝、植保、食品、資環、生物工程等專業開設的一門重要專業基礎課，旨在提高學生的實驗技能和培養學生的科研素養?！暗矸勖富盍y定”實驗是青島農業大學為本科生開設的基礎生化實驗課的內容之一[1]，是針對生物化學理論課程中新陳代謝部分設置的實驗，以便于通過實驗的實踐操作，讓學生掌握和理解生物體內新陳代謝的本質和酶的基本特性。

該實驗采用3，5二硝基水楊酸比色法（DNS法），先提取定量小麥芽（發芽3-5天）中的淀粉酶，然后用分光光度法比色測定淀粉酶活力，實驗既有酶的提取，又有活力測定，活力測定時既有測定管，又有對照管，還有空白管，致使很多學生錯將酶反應中的對照管直接用作比色測定時的調零空白管，重做現象時有發生，原本并不復雜的實驗，因為步驟繁雜，學生常常顧此失彼，不僅不能在規定的時間內完成實驗，而且嚴重的影響了學生的積極性和實驗教學效果；此外，學生操作時，往往因取材部位不同，而測定結果迥異；學生實驗報告也存在書寫混亂不規范的現象。鑒于此，筆者對該實驗操作步驟做了些適當的調整和改進，化繁為簡，不但減少了實驗誤差，而且提高了實驗的準確性；同時在實踐中總結出學生實驗操作中的注意事項，減少了學生實驗出錯的幾率，提高了實驗教學效果；明確了實驗報告要求和書寫格式，使學生的報告更加規范?，F將結果報告如下。

1 實驗的基本原理

萌發的種子中存在α-淀粉酶和β-淀粉酶兩種淀粉酶，利用β-淀粉酶耐酸不耐熱的特性，在高溫（70℃）下處理使得β-淀粉酶鈍化而測定α-淀粉酶的酶活性（α-淀粉酶耐熱不耐酸，在pH3.6下則發生鈍化），然后在不經過高溫（70℃）處理下測得總酶的活力。

采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定。淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖能將3，5-二硝基水楊酸還原生成棕紅色的3-氨基-5-硝基-水楊酸，其顏色的深淺與麥芽糖的含量成正比，故可求出麥芽糖的含量。常用單位時間內生成麥芽糖的毫克數表示淀粉酶活性的大小。然后利用同樣的原理測得兩種淀粉酶的總活性。

2 實驗材料、試劑和儀器

①材料：萌發3-5天的小麥，芽長1-1.5cm，根長1-3cm。②試劑：3，5-二硝基水楊酸，酒石酸甲鈉，0.4mol/L氫氧化鈉溶液，pH5.6檸檬酸緩沖液，麥芽糖標準液（1mg/mL）。③儀器：751分光光度計，離心機，水浴鍋，離心機，天平，容量瓶，研缽，試管（25mL）。

3 原實驗步驟

稱取2克麥芽（全麥芽）研成勻漿后定容至50mL，離心后上清液即為酶提取液，然后分別設置反應條件，給予α-淀粉酶和（α+β）淀粉酶反應。在標準曲線做好之后，另取8只15mL試管，分別取上述反應液各2mL，然后各管加入3，5-二硝基水楊酸2mL，煮沸5min后，冷卻后，加蒸餾水至15mL，520mn下比色，吸光值平均后在標準曲線上查相對應的麥芽糖含量，帶入公式計算，求得α-淀粉酶和（α+β）淀粉酶總酶的活力。

4 改進后實驗步驟

根據劉瑞征等報道[2]，發芽小麥胚端淀粉酶活力比后端淀粉酶活力高，故改進后實驗選擇稱取2克去根的麥芽，研成勻漿后定容至50mL，離心后上清液即為酶提取液，取8只25mL試管，在設置的反應條件下反應之后，直接向各管加入3，5-二硝基水楊酸2mL，煮沸5min后，冷卻后，加蒸餾水至25mL，520mn下比色，吸光值平均后在標準曲線上查相對應的麥芽糖含量，帶入公式計算，求得α-淀粉酶和（α+β）淀粉酶總酶的活力。

5 實驗報告的規范

改進前學生寫實驗報告，沒有統一的要求和格式，改進后我們統一了要求，規范了學生實驗報告的書寫，學生在寫報告時，便于理清思路，教師批改也更方便明了。

6 效果評價

實驗中，小麥發芽種子的研磨、酶提取液的轉移定容、離心等實驗操作均會損失部分提取液而帶來實驗誤差。改進前，用量筒測量提取液體積誤差較大，在將提取液稀釋10倍時又放大了誤差，這些都會影響到最后實驗數據和實驗結果；改進后，將量筒測量體積和稀釋兩步驟合并為用容量瓶定容一個步驟，而且用容量瓶定容體積比量筒更精確；原本要用16只15mL試管分三步進行操作，改進后只需用8只25mL試管一次操作，避免了反應液轉移過程中帶來的誤差，因此，改進后的實驗既簡化了實驗操作，縮短了實驗時間又減少了實驗誤差，提高了實驗準確性；另外，對學生的實驗報告給出了明確的要求和統一的規范格式，既能夠幫助學生清晰實驗設計思路，更好地理解實驗過程，便于書寫，又方便了教師批改實驗報告。

7 實驗中的注意事項

①嚴格控制溫度。取樣前，提前把水浴鍋的溫度調整到所需溫度；底物淀粉液、提取液、水楊酸需要40℃預熱保溫，以確保各試管反應液溫度一致，減小誤差。

②嚴格控制時間。酶反應時，先加底物溶液，后加酶提取液，且各管添加試劑時間和順序要一致，以避免加樣先與后的時間差異對實驗結果的影響；要嚴格把握反應時間5min，加入NaOH終止反應要迅速，以保證反應時間的一致性；四支測定管及空白管不要混淆。

③操作要迅速、準確。研磨樣品速度要快，轉移樣品要完全，以避免樣品損失帶來的誤差；70℃水浴后要在冰浴條件下迅速冷卻，避免β-淀粉酶恢復活性而給測定帶來誤差。移液管移液要準確；比色之前，一定要搖勻試管中的溶液，且要避免比色皿的差異帶來的誤差。

[1]高玲.朱新產等主編.基礎生物化學實驗教程[M].科學出版社，2012.6.

[2]劉瑞征，鄭慧芬.發芽小麥籽粒不同部位的α——淀粉酶活力[J].糧食儲藏，1984，03：12-14.

[3]林鉆輝，周艷華.農業院校大學生創新思維培養研究[J].中國城市經濟，2011（24）.