雌激素及雌激素受體α減輕谷氨酸對神經細胞的損傷*

朱加應， 張廣云， 王建怡， 袁 平， 胡 曉△

谷氨酸(glutamate，Glu)廣泛分布于哺乳動物中樞神經系統(central nervous system，CNS)，是腦內含量最豐富的興奮性神經遞質，在突觸可塑性和介導突觸興奮性活動等方面發揮著重要的作用。Glu的受體，特別是N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)在突觸可塑性中發揮了重要作用，對腦內神經元生長發育、分化、遷移、成熟、修復等方面具有重要影響［1］。但過多Glu積聚可導致Glu受體的過度激活引起鈣超載，從而激活神經毒性信號轉導途徑，啟動一系列細胞反應，包括線粒體膜的去極化，氧自由基的產生和蛋白酶的激活，最后導致細胞凋亡和壞死，這就是Glu的興奮毒性損傷［2］。不少研究報道多種神經系統疾病的發生發展與Glu的興奮毒性損傷密切相關。

雌激素是內分泌系統產生的類固醇激素，除具有傳統調控生殖系統的功能及其生長發育作用外，雌激素及其受體還可參與CNS的多種功能調節并發揮保護作用。普遍認為，雌激素的細胞反應性和敏感性主要是由2個不同的雌激素受體(estrogen receptor，ER)亞型介導:ERα 和 ERβ。Xia等［3］應用選擇性ER調節劑和ER特異性拮抗劑，發現雌激素減輕Glu誘導的神經細胞損傷可能主要依賴ERα完成，也有研究發現雌二醇刺激發育中海馬神經細胞Glu能突觸的形成是通過ERα介導的［4］。鑒于目前對其具體作用機制尚不清楚，本實驗通過構建Glu誘導的神經細胞損傷模型，應用雌激素和ERα重組慢病毒干預該損傷模型，觀察神經細胞損傷程度，檢測NMDAR1和囊泡膜谷氨酸轉運體蛋白1(vesicular glutamate transporter protein 1，VGLUT1)mRNA和蛋白表達，探討雌激素和ERα對Glu誘導神經細胞損傷保護作用的可能機制，期望為相關領域疾病的預防和治療提供新的思路。

材料和方法

1 病毒和動物

空慢病毒(V-RFP-flag)及ERα重組慢病毒(VERα-RFP-flag)由貴州省人民醫院中心實驗室保存;C57BL/6新生鼠購自重慶醫科大學實驗動物中心。

2 主要試劑

SYBR Master Mix試劑盒、Trizol和cDNA合成試劑盒購自TaKaRa;兔抗小鼠NMDAR1多克隆抗體、兔抗小鼠VGLUT1多克隆抗體及羊抗小鼠Ⅱ抗購自Santa Cruz;小鼠抗人ERα單克隆抗體購自LifeSpan Biosciences;羊抗兔Ⅱ抗(攜帶FITC綠色熒光)和小鼠神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)抗體購自博士德公司;蛋白定量試劑盒購自HyClone-Pierce;ECL-Plus試劑盒購自Amersham;PVDF膜購自Bio-Rad;β-雌二醇購自TCI;L-谷氨酸購自北京索萊寶科技有限公司;D-Hank′s緩沖液、胰蛋白酶、DMEM-F12培養基和胎牛血清購自 Hy-Clone;B27培養基購自Gibco;L-多聚賴氨酸購自Sigma;Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。

3 引物合成

引物合成由大連寶生物工程有限公司完成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

4 方法

4.1 Glu誘導神經細胞損傷模型的建立及鑒定 將出生24 h內的C57BL/6新生鼠置于75% 乙醇中消毒3 min，剝離新生鼠的大腦皮層組織放于預冷DHank′s緩沖液中，按以往實驗方法原代培養神經細胞并用NSE免疫組化方法鑒定神經細胞純度［5］。用D-Hank′s液洗2遍，并換上無血清基礎培養基，用加入含50 μmol/L Glu的 D-Hank′s緩沖液誘導神經細胞損傷并對該模型進行鑒定［6］。

4.2 V-ERα-RFP-flag感染Glu誘導的神經細胞用MOI=7的V-RFP-flag感染Glu誘導的神經細胞［7］。在倒置顯微鏡下每天觀察紅色熒光的表達情況，感染72 h可見到紅色熒光明顯表達。用MOI=7的V-ERα-RFP-flag感染 Glu誘導的神經細胞，VERα-RFP-flag感染組和 V-RFP-flag感染組各設5孔，感染后3 d用實時定量PCR和Western blotting方法檢測2組細胞中ERα mRNA和蛋白表達。

4.3 實時熒光定量PCR和Western blotting檢測受感染神經細胞中ERα mRNA和蛋白表達 用Trizol提取的神經細胞的總RNA，經逆轉錄合成cDNA，根據SYBR Master Mix試劑盒的產品說明書進行實時熒光定量PCR檢測，β-actin作為內參照。擴增條件:95℃預變性30 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環。同時設RT質控和PCR擴增2個空白對照。根據目的基因與內參照基因的Ct差值，得到標本ERα mRNA的相對表達量。同時，用PBS清洗神經細胞，收集細胞并用裂解液裂解，用細胞刮刮下裂解產物，14 000 r/min離心5 min去除細胞碎片。使用蛋白定量試劑盒測定裂解產物的蛋白濃度并調整為2 g/L。用SDS-PAGE電泳分離等量的蛋白質，然后電轉移至PVDF膜。將膜浸入TBST 5%脫脂奶粉中室溫放置1 h，與1∶500稀釋的小鼠抗 ERα抗體和1∶2 500稀釋的抗GAPDH抗體共孵育，4℃過夜。與1∶5 000稀釋的羊抗鼠IgG在室溫下孵育1 h。經過多次清洗，用 ECL-Plus試劑盒觀察蛋白條帶。GAPDH作為內參照。使用凝膠成像分析系統計算ERα條帶密度/GAPDH條帶密度的相對值，以測定蛋白表達水平。實驗至少重復5次。

4.4 分組 Glu誘導的神經細胞損傷模型經鑒定構建成功后，將細胞隨機分為:(1)對照組:用含有MOI=7的V-RFP-flag無血清培養基感染Glu誘導的神經細胞;(2)雌激素組:加入終濃度為10 nmol/L β-雌二醇的無血清培養基持續干預Glu誘導的神經細胞;(3)慢病毒組:用含有MOI=7的V-ERα-RFP-flag無血清培養基感染Glu誘導的神經細胞。每組細胞各設5孔，將3組細胞分別作相應處理后放于37℃、5%CO2的培養箱中培養3 d后分別檢測各組的細胞活性，實時熒光定量PCR和免疫熒光法分別檢測NMDAR1和VGLUT1 mRNA和蛋白表達水平。

4.5 Annexin V-FITC/PI方法檢測神經細胞凋亡率將各組的神經細胞分別用0.25%胰蛋白酶1 mL消化1～3 min，在倒置顯微鏡下觀察消化情況，基礎培養基中和，將消化好的神經細胞置于低速離心機上以1 500 r/min離心5 min，PBS洗2次，每孔收集(1～5)×105細胞，加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL propidium iodide，混勻，室溫，避光，反應 5～15 min，置于流式細胞儀上檢測神經細胞凋亡率。

4.6 實時熒光定量PCR檢測各組神經細胞NMDAR1和VGLUT1 mRNA表達 方法同4.3中ERα的mRNA檢測。

4.7 免疫熒光染色檢測NMDAR1和VGLUT1蛋白表達 取生長于蓋玻片處理后的神經細胞，4%甲醛溶液固定，0.4%Triton X-100透化5～15 min，10%BSA封閉1 h后，用兔抗NMDAR1和VGLUT1室溫孵育1 h，對應的熒光Ⅱ抗(1∶100 稀釋)室溫1 h，1 mg/L DAPI作用5 min復染細胞核。95%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察NMDAR1和VGLUT1的蛋白表達情況，實驗重復3次，每次實驗拍攝不同視野的3張圖片，每張圖片隨機采集5個不同重疊的高倍視野，輸入圖像分析系統中，測定每個視野的積分吸光度(IA)，取5個視野平均值為該張圖片單位面積的IA值。

5 統計學處理

采用SPSS 16.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 神經細胞的培養

經顯微鏡觀察神經細胞生長良好，細胞在培養12 h后開始貼壁，24 h后分化生長成梭形，見圖1A;3 d后可見神經細胞間形成稀疏網絡，7 d后可見神經細胞胞體飽滿，細胞核突起光暈明顯，立體感強，軸、樹突細長交織成網，見圖1B，此時期是感染的最佳時期。

Figure 1.Primarily cultured mouse cerebral cortical neural cells(scale bar=0.1 mm).A:24 h;B:7 d.圖1 小鼠大腦皮層神經細胞原代培養

2 神經細胞鑒定

分為鑒定組和對照組各3孔，對照組用0.01 mol/L PBS代替NSE抗體，排除假陽性可能。對照組細胞不被染色的為陰性細胞(圖2A);鑒定組為培養7 d的神經細胞，在染色后胞漿中充滿棕褐色顆粒為陽性細胞(圖2B)，以3個以上視野中陽性神經細胞的數目占總細胞的比計算神經元純度，經計數鑒定組神經元純度達90%以上。

Figure 2.The purity of neurons identified by NSE immunohistochemistry(scale bar=0.1 mm).A:control group;B:identified group.圖2 免疫組化方法鑒定NSE陽性的神經元

3 V-ERα-RFP-flag感染神經細胞

MOI=7的V-RFP-flag和V-ERα-RFP-flag感染神經細胞72 h后，在熒光顯微鏡觀察下可見到紅色熒光表達，見圖3。實時熒光定量PCR結果顯示，與VRFP-flag感染的神經細胞相比，感染V-ERα-RFP-flag的神經細胞中ERα mRNA表達增高(6.237±1.417)×103倍(P＜0.01)，見圖4A。感染 V-ERα-RFP-flag的神經細胞(泳道1)中的ERα蛋白表達顯著高于感染V-RFP-flag的神經細胞(泳道2)，見圖4B。

Figure 3.RFP expression in V-ERα-RFP-flag-infected neural cells(Scale bar=0.1 mm).A:phase-contrast;B:fluorescence.圖3 V-ERα-RFP-flag感染神經細胞后紅色熒光觀察

Figure 4.Real-time quantitative PCR and Western blotting were used to detect the expression of ERα in V-ERα-RFP-flag-infected neural cells.A:ERα mRNA quantification;B:the expression of ERα protein.Mean±SD.n=5.＊＊P ＜0.01 vs V-RFP-flaginfected neurons.圖4 實時熒光定量PCR及Western blotting檢測V-ERα-RPF-flag感染神經細胞中ERα

4 神經細胞凋亡率

與對照組相比，雌激素組和慢病毒組細胞凋亡率降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見圖5、表2。

Figure 5.The apoptosis of the cells in control group，estrogen group and lentivirus group.A:control group;B:estrogen group;C:lentivirus group.圖5 對照組、雌激素組和慢病毒組的細胞凋亡情況

表2 各組神經細胞凋亡率和NMDAR1、VGLUT1 mRNA水平Table 2.Apoptotic rate and mRNA expression of NMDAR1 andVGLUT1 in the neural cells(Mean±SD.n=5)

5 實時熒光定量PCR和免疫熒光染色檢測NMDAR1和VGLUT1

實時熒光定量PCR結果顯示，雌激素組和慢病毒組的NMDAR1和VGLUT1 mRNA表達與對照組相比均下調，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。經顯微鏡觀察，NMDAR1和VGLUT1主要表達在神經細胞的胞漿、胞膜、軸突和樹突，尤其是突觸起始部位，表達尤為明顯，并且發現雌激素組和慢病毒組2種蛋白雖也有表達，但表達強度卻明顯低于對照組，對各組圖片的平均IA值進行統計學分析發現，與對照組相比，雌激素組和慢病毒組NMDAR1和VGLUT1的 IA值降低，差異有統計學意義(P＜0.01)，見圖 6、表 3。

Figure 6.The protein expression of NMDAR1 and VGLUT1 detected by immunofluorescence staining(scale bar=0.05 mm).A，B，C:NMDAR1 expression;D，E，F:VGLUT1 expression;A，D:control group;B，E:estrogen group;C，F:ientivirus group.圖6 免疫熒光染色觀察各組神經細胞NMDAR1和VGLUT1蛋白表達

表3 各組神經細胞NMDAR1和VGLUT1 IA值Table 3.The IA values of NMDAR1 and VGLUT1 in the neural cells(Mean±SD.n=5)

討 論

Glu廣泛分布于哺乳動物CNS，正常狀態下，神經元胞漿的 Glu濃度在10 mmol/L，胞外則為0.6 μmol/L，突觸間隙為1 μmol/L，而在突觸終端囊泡內可達100 mmol/L，當突觸間隙內Glu過度積聚時，會導致Glu受體的過度激活并進一步引起興奮性毒性損傷。Glu通過Glu受體被激活后實現腦內眾多功能，包括調節神經遞質的釋放、突觸的可塑性、學習記憶以及突觸長時程增強和長時程抑制等。Glu受體分為離子型和促代謝型受體兩大類，代謝型受體屬G蛋白偶聯受體家族。離子型Glu受體主要包括NMDAR、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑酸受體和紅藻氨酸受體［8］。其中NMDAR是配體門控離子通道，通過不同的NMDAR觸發不同的細胞內信號誘導神經元的死亡［9］。通常認為細胞外液中沒有使Glu失活的水解酶系統，從神經末梢釋放出來的Glu，其清除和失活是通過位于突觸前膜和神經膠質細胞膜上的Glu轉運體的攝取而實現的，當Glu轉運體表達或功能失調時，引起突觸間隙或胞外Glu大量蓄積或者Glu濃度低于正常水平，導致疾病發生。因此，Glu轉運體對于興奮性氨基酸的再循環，興奮性信號的終止以及保護神經細胞具有特別重要的意義。Glu轉運體總體上分為兩大類:VGLUT和質膜型Glu轉運體，VGLUT有3種亞型，其中VGLUT1和VGLUT2是其主要的亞型，可將胞內Glu轉運入囊泡進行隔離，儲存，釋放。

已有研究報道，雌激素對CNS起著重要的保護和調節作用［10］，還可影響記憶、學習以及認知功能。研究發現雌激素可降低阿爾茨海默病的發病率［11］，提高腦損傷后的修復能力，減輕腦損傷后腦細胞的死亡程度［12］，同時有研究報道雌激素對Glu引起的神經細胞損傷具有重要的抵抗和保護作用［13］，這種保護作用可能主要是通過抑制NMDAR及受體介導的動作電位、調控L型Ca2+通道、抑制Ca2+內流從而減輕Glu毒性誘導的細胞死亡［14-15］;另一方面雌激素可通過抑制高壓電激活的Ca2+通道從而減少Glu誘導的細胞內Ca2+釋放達到神經保護作用。Schreihofer等［16］在研究中發現雌激素亦可以通過減少Ca2+濃度，從而對抗Glu興奮毒性，減輕細胞損傷。Occhiuto等［17］研究發現，雌激素可以明顯提高受損細胞的存活能力，降低皮層神經細胞內Glu脫氫酶的釋放量，即可以降低Glu含量，同時發現異黃酮還可以阻止Glu引起的細胞形態改變，提示雌激素對Glu誘導的神經細胞損傷具有保護作用。本研究也證實了雌激素的這種神經保護作用，在本實驗中雌激素組的細胞凋亡率低于對照組，說明雌激素可以減少Glu興奮毒性引起的細胞損傷，提高細胞生存率，該實驗結果與相關報道一致。

ERα是雌激素發揮生物學效應的必要因素，并且已有研究報道雌激素對Glu興奮毒性引起細胞損傷的保護作用可能通過ERα介導完成。Xia等［3］應用ER特異性拮抗劑和選擇性ER調節劑，發現ERα在介導雌激素對抗Glu興奮毒性過程中發揮了重要作用。Kuo等［18］利用成年雌鼠下丘腦星型膠質細胞，并給予1型Glu代謝性受體、ERα和ERβ不同的調節劑后發現ERα可能介導下丘腦神經膠質細胞中雌二醇-信號機制引起黃體酮合成。在本實驗中，慢病毒組的細胞凋亡率低于對照組，提示ERα和雌激素對Glu興奮毒性引起的細胞損傷具有相似的保護作用。

NMDAR1是NMDAR中的主要亞型之一，研究報道NMDAR1的過度激活是引起Glu興奮毒性損傷的一個重要原因［19］。質膜Glu轉運體Glu-天冬氨酸轉運蛋白(glutamate-aspartate transporter，GLAST)亞型主要位于中樞膠質細胞和神經元的細胞膜上，其功能是在病理狀態下可以快速清除突觸間隙內Glu，終止興奮性傳遞。而VGLUTs，尤其是VGLUT1亞型是Glu能神經元和它們軸突末端高度特異的標志之一，其作用是使Glu在囊泡內形成相對高濃度的聚集，并特異地促進Glu釋放進突觸間隙，維持Glu的正常運轉。不少研究報道VGLUT1減少，可導致Glu釋放入突觸間隙的量減少并引起多種CNS疾病，如老年癡呆病［20］、精神分裂癥［21］等;Cheng 等［22］用小鼠模型研究VGLUTs與大腦記憶與學習功能關系時發現，用實時熒光定量PCR檢測VGLUTs mRNA后提示VGLUT1 mRNA表達下調可引起學習和記憶功能的減退，即VGLUT1可提升突觸間Glu傳遞，增強神經細胞興奮性傳導。同時有研究報道在膠質細胞中ERα的激活可以引起GLAST的下調，減少對Glu的攝取［23］。本實驗發現雌激素組和慢病毒組VGLUT1和NMDAR1 mRNA表達量及蛋白IA值均少于對照組，提示雌激素對抗Glu興奮毒性發揮神經保護作用，而該作用可能是ERα介導，并通過抑制NMDAR1及VGLUT1完成。

總之，通過本實驗我們觀察到雌激素及ERα重組慢病毒干預Glu誘導的神經細胞損傷模型，可減輕Glu的興奮性神經毒性，而該作用機制可能是抑制了Glu受體NMDAR1及Glu轉運體VGLUT1完成。但本項研究僅局限于細胞學實驗，需要進一步觀察在體實驗中雌激素及ERα對Glu受體及轉運體的作用，分析其作用通路，為其作用機制提供更多依據。

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