謝 青，陳林林， 李 治，單曉亮， 聶 丹，段玉潔， 權會琴，唐 霓

(重慶醫科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室，重慶400016)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，長期慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是導致HCC的主要病因［1］。Wnt/β-catenin信號通路是廣泛存在于真核生物中的一條高度保守的信號通路，其異常激活與多種腫瘤如肝癌、子宮癌、黑色素瘤等的發生發展密切相關［2］。研究證實，乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)可以通過異常激活 Wnt/βcatenin信號通路，參與HCC的發生，但具體機制不明［3］。

HCC患者中普遍存在異質的HBx缺失突變體，表達截短的HBx蛋白致其功能發生改變，并極可能參與肝細胞的惡性轉化［4］。為此，我們構建了一系列HBx截短突變體，這些區域涵蓋了已有文獻報道的HCC組織中HBx蛋白自然截短突變的主要位點，并且涉及HBx的反式激活域等功能域。本實驗通過細胞轉染和熒光素酶報告系統，研究HBx不同截短突變體在細胞內的定位及其對Wnt/β-catenin信號通路轉錄活性的影響，探討HBV相關肝癌的發生機制。

材料和方法

1 主要質粒和細胞

人肝癌細胞系Huh7、人胚腎上皮細胞HEK293、真核表達載體 pAdTrack-TO4-HBx、pEGFP-C1、pTop-Luc以及E.coli DH10B均為本實驗室保存。

2 主要試劑

Taq DNA聚合酶購自TaKaRa;限制性核酸內切酶HindⅢ和KpnⅠ、T4 DNA連接酶、Wizard質粒提取試劑盒及螢光素酶活性檢測試劑盒均為Promega產品;抗綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)抗體購自碧云天;鼠抗IgG購自Abcam;1%青/鏈霉素和DMEM培養基購自HyClone;胎牛血清購自 Gibco;4′，6-聯脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4’，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)購自Roche;LipofectamineTM2000購自 Invitrogen;發光底物ECL購自Millipore;其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。引物序列見表1，由上海Invitrogen公司合成。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3 主要方法

3.1 HBx截短突變體的構建及鑒定 根據HBx基因全長序列設計5對截短體［缺失C端49～154 aa(HBx1)、C 端85～154 aa(HBx2)、N 端1～57 aa+C端141～154 aa(HBx3)、N 端1～57 aa(HBx4)或N端1～84 aa(HBx5)］的引物，以 pAdTrack-TO4-HBx質粒作為模板，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增上述截短突變體，反應條件:96℃ 2 min，92 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35 個循環，最后在72℃延伸5 min。取2 μL PCR產物在2%瓊脂糖凝膠電泳、用凝膠成像儀記錄。PCR產物用無水乙醇沉淀法純化后克隆入pEGFP-C1載體的HindⅢ和KpnⅠ酶切位點，T4 DNA連接酶16℃過夜連接，產物轉化E.coli DH10B感受態菌。挑選陽性克隆，擴增后提取質粒進行酶切鑒定并測序。

3.2 細胞轉染及熒光顯微鏡觀察 將HEK293細胞按每孔2×105細胞鋪于24孔板，待細胞生長至80%融合率時進行轉染。將0.5 μg質粒和2 μL LipofectamineTM2000稀釋到50 μL無血清DMEM中制備轉染復合物，輕輕混勻，室溫靜置20～30 min。用500 μL無血清DMEM輕輕洗滌細胞后，加入250 μL無血清DMEM至每孔。將轉染復合物加入24孔板，輕輕搖勻后，置CO2孵箱中37℃孵育。轉染后4 h用1 mL含10%胎牛血清的DMEM替換轉染液。轉染后36 h，用4%多聚甲醛固定，DAPI染核后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察HBx和增強型GFP(enhanced GFP，EGFP)融合蛋白的表達及其細胞定位。3.3 重組蛋白的Western blotting檢測 取100 μL的細胞裂解液，裂解瞬時轉染各截短突變體基因的HEK293細胞，收集上清液，每孔上樣量20 μg，12%SDS-PAGE分離后，轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，將膜孵以抗GFP抗體4℃過夜。TBST洗膜40 min，HRP酶標鼠抗IgGⅡ抗室溫孵育1 h。洗滌后，加入底物發光劑ECL 1 mL，10 s后吸干發光劑，用單層透明薄膜包裹后曝光膠片。

3.4 螢光素酶報告基因檢測 按照3.2的方法，Huh7細胞瞬時轉染pTOP-Luc報告質粒，12 h后重鋪細胞，待細胞貼壁后分別轉染pEGFP-C1及各HBx不同截短突變體，并設立空白對照組。轉染后24 h，按照Promega公司螢光素酶檢測試劑盒說明書進行操作，檢測pTOP-Luc螢光素酶活性。具體方法:將24孔板中的細胞用PBS充分洗滌后，每孔加入100 μL的1×Passive Lysis Buffer，充分裂解細胞約10～15 min后，將其收集于1.5 mL EP管中，室溫14 000 r/min離心10 min。取50 μL上清于另一1.5 mL EP管中，加入20 μL螢光素酶底物工作液，充分混勻后再立即用螢光發光計測量螢火蟲螢光素酶的活性。每組的相對螢光素酶活性用實驗組螢火蟲螢光素酶活性與對照組螢火蟲螢光素酶活性的比值來表示。實驗重復3次。

4 統計學處理

每次實驗設3個復孔，進行獨立的3次重復實驗。用SPSS 15.0統計軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，各組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 HBx截短突變體目的基因的PCR擴增

以pAdTrack-TO4-HBx為模板，分別用相應引物擴增目的基因 HBxWT、HBx1、HBx2、HBx3、HBx4和HBx5，PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，DNA片段的大小分別約為 462 bp、144 bp、255 bp、248 bp、290 bp和209 bp，與預期結果一致，見圖1、2。切下目的條帶，用膠回收試劑盒回收DNA，經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，為單一條帶DNA。

Figure 1.Schematic diagram of HBx-truncating mutation constructs.HBxWT:full length of HBx protein;HBx1:1～48 aa of HBx protein;HBx2:1～84 aa of HBx protein;HBx3:58～140 aa of HBx protein;HBx4:58～154 aa of HBx protein;HBx5:85～154 aa of HBx protein;fHBxWT，fHBx1，fHBx2，fHBx3，fHBx4 and fHBx5:fusion proteins of HBxWT，HBx1，HBx2，HBx3，HBx4and HBx5with EGFP，respectively.圖1 HBx截短突變體結構模式圖

Figure 2.PCR products of HBx truncated mutants.Lane 1:HBxWT(462 bp);Lane 2:HBx1(144 bp);Lane 3:HBx2(255 bp);4:HBx3(248 bp);Lane 5:HBx4(290 bp);Lane 6:HBx5(209 bp);Lane 7:pEGFP-C1 vector(47 000 bp);M1:DNA marker 2000;M2:DNA marker λ-EcoT14Ⅰ.圖2 HBx截短突變體的PCR擴增

2 HBx截短突變體重組質粒的鑒定

重組質粒 fHBxWT，1～5用 HindⅢ和 KpnⅠ雙酶切后，經2%瓊脂糖凝膠電泳，可見約4.7 kb的pEGFPC1 質粒片段和 462 bp、144 bp、255 bp、248 bp、290 bp和209 bp的目的基因片段，符合預期結果，見圖3。重組質粒測序鑒定，證實克隆片段序列與HBx全長基因組中的對應序列相一致，且插入方向正確。

Figure 3.Identification of HBx-truncating mutation recombinant plasmids digested by restricted enzymes HindⅢand KpnⅠ.Lane 1:fHBxWT;Lane 2:fHBx1;Lane 3:fHBx2;Lane 4:fHBx3;Lane 5:fHBx4;Lane 6:fHBx5;Lane 7:pEGFP-C1 vector;M1:DNA marker 2000;M2:DNA marker λ-EcoT14Ⅰ.圖3 HBx截短突變體重組質粒的酶切鑒定

3 HBx截短突變體重組質粒的表達

融合 EGFP的 HBx截短突變體瞬時轉染HEK293細胞。48 h后收集細胞總蛋白，Western blotting檢測各截短突變體的表達情況，均檢測到與預計相對分子量相一致的融合表達蛋白，見圖4。

4 HBx截短突變體在HEK293細胞中的定位

融合EGFP的HBx截短突變體瞬時轉染HEK293細胞。36 h后固定細胞，DAPI染核后于激光共聚焦顯微鏡下觀察HBx不同截短突變體在HEK293細胞中的定位。fHBxWT主要定位于HEK293細胞的胞質中，呈不均一的粗大顆粒，胞核中也有少量表達。N端缺失突變體(fHBx4和fHBx5)主要定位于細胞核周胞質;C端缺失突變體(fHBx1和 fHBx2)在胞質胞核中則呈均勻分布;N端1～57 aa+C端141～154 aa缺失突變體(fHBx3)的細胞定位情況則類似于fHBxWT，見圖5。

5 HBx截短突變體對Wnt/β-catenin轉錄活性的影響

本實驗中，報告質粒pTOP-Luc帶有6個能夠被β-catenin識別的 T細胞因子 4(T-cell factor 4，TCF4)重復序列，其螢光素酶的表達受轉錄復合物β-catenin/TCF4的調節，兩者呈正相關關系。因此，報告基因產物的螢光素酶活性反映了 β-catenin/TCF4活性，即經典Wnt通路的活性。在Huh7細胞中外源轉染fHBxWT后螢光素酶活性約為空白對照組的 69.5 倍，轉染 fHBx1、fHBx2、fHBx3、fHBx4和 fHBx5后其螢光素酶活性較fHBxWT明顯下降，分別下降了78.7%、84.7%、75.7%、93.8%和95.5%，見圖6。

Figure 4.The expression of fusion proteins of HBx truncated mutants with EGFP in HEK293 cells.Vector:EGFP protein;mock:total protein of HEK293 cells.GAPDH served as a loading control.圖4 HBx截短突變體重組質粒融合蛋白的表達

Figure 5.The expression and location of fusion proteins of HBx-truncated mutants with EGFP in HEK293 cells.Nuclei were stained with DAPI.Scale bar=50 μm.圖5 HBx截短突變體重組質粒在HEK293細胞中的定位

Figure 6.Effects of HBx truncated mutants on β-catenin/TCF4 transcriptional activity of Wnt signaling pathway in Huh7 cells.1:empty cell control;2:pEGFP-C1 vector;3:fHBxWT;4:fHBx1;5:fHBx2;6:fHBx3;7:fHBx4;8:fHBx5.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 3.圖6 Huh7細胞中HBx截短突變體對Wnt/β-catenin轉錄活性的影響

討 論

HBx基因定位于HBV基因組第1 374～1 836位核苷酸之間，是HBV DNA中最小的開放讀碼框，也是功能重疊最明顯的區域，編碼由145～154個氨基酸組成、分子量約為17 kD的HBx蛋白。根據HBx蛋白的氨基酸序列與土撥鼠肝炎病毒(woodchuek hepatitis virus，WHV)和地松鼠肝炎病毒(ground squirrel hepatitis virus，GSHV)序列的同源性，將HBx分成 A(1～20 aa)、B(21～57 aa)、C(58～84 aa)、D(85～119 aa)、E(120～140 aa)和 F(141～154 aa)6個區域。

近年來的研究發現，HBV DNA尤其是HBx基因頻繁整合于宿主基因組，導致染色體的不穩定和缺失突變體的發生，與 HCC的發生發展密切相關。Hoare等［5］發現在 18例肝癌患者中有 10例(58.8%)存在 HBx缺失突變。Chen等［6］對 HBsAg陽性的肝癌患者進行HBx檢測，通過序列比對，發現大部分腫瘤HBx蛋白存在羧基端缺失。另外，研究發現在一些HCC癌組織中分別發現了C端截短20或35個氨基酸的HBx截短體［7-9］。因此，在肝癌組織中HBx蛋白的缺失突變，尤其是C端缺失是一個主要特征。C端缺失突變的HBx具有完全不同于野生型HBx的功能。腫瘤組織中的HBx缺失突變體能夠抑制野生型HBx抗增殖和反式激活能力，而C端缺失突變體則能增強原癌基因ras及c-myc的轉化能力，并明顯促進肝癌細胞的增殖與浸潤能力［10-13］。同時，越來越多的證據也證實，HBx缺失突變體可以通過p53、NF-κB等途徑取消野生型HBx所具有的促細胞凋亡能力［14］。因此，HBx的不同缺失突變，尤其是C端的缺失，使其在調節細胞增殖、分化及轉化的過程出現紊亂，可能與HCC的發生發展相關。

通過我們的實驗發現，HBx不同編碼區缺失突變體在HEK293細胞中的定位不同，這可能與細胞中HBx表達水平的高低密切相關。有研究表明，在瞬時轉染過表達系統中，HBx主要位于胞漿并附著包膜，小部分在核內。HBx保留有核輸出信號，可與核受體Crm-1結合，誘導HBx的出核。另外，HBx還可以與一些轉入因子如p53、Smad4相互作用，從而誘導HBx在胞漿與胞核之間的穿梭調節［15］。HBx具有廣泛的轉錄激活能力，可通過激活胞漿信號轉導或直接與相關轉錄因子相互作用調控宿主基因的表達。HBx的這種雙重轉錄調節作用與其在細胞內的表達水平以及細胞定位密切相關。當HBx在細胞中呈低量表達時，它主要分布于胞核，通過與轉錄因子(如CREB、AP-1等)或基礎轉錄元件TATA結合蛋白等相互作用直接調控多種基因的轉錄效應;當在細胞中高水平表達時，HBx則主要聚集在胞質，通過影響線粒體功能，從而干預細胞內復制的信號轉導系統，參與對細胞增殖、凋亡等的調控［16］。

Wnt信號通路是真核生物中的一條廣泛存在的高度保守的信號通路，在胚胎的發育過程中起到重要的作用。目前研究發現，Wnt信號通路與多種腫瘤的發生密切相關，如肝癌、肺癌、結腸癌、黑色素瘤等［2］。胞漿內 β-catenin表達或穩定性增高是腫瘤發生過程的中心事件，其原因可歸納為三大類:(1)異常Wnt信號，導致β-catenin降解障礙;(2)β-catenin結構改變，不能被磷酸化;(3)參與β-catenin降解調節的分子改變，如Wnt信號途徑負性調節子(APC、Axin和β-TrCP)的失活突變、正性調節子Dvl過度表達、Wnt蛋白拮抗劑(如sFRP、WIF-1和DKK-1)的表達下調等［2，17-18］。

通過脂質體介導的轉染方法，我們發現HBx不同編碼區缺失突變體對Wnt/β-catenin信號通路轉錄活性的作用不同。與野生型HBx相比，HBx不同截短突變體對Wnt/β-catenin信號通路轉錄活性均明顯下降，可能與HBx缺失突變體對胞漿中β-catenin的表達及穩定性的改變有關。最近的研究顯示HBx可以通過甲基化E-cadherin啟動子，抑制E-cadherin轉錄水平上的表達，從而穩定肝癌細胞質中的β-catenin，使其在胞質中積聚，入核后與TCF家族的轉錄因子相互結合，導致下游靶基因異常活化，最終參與腫瘤的發生發展［19］。此外，HBx還能刺激受體酷氨酸激酶，激活Ras/Raf/MAPK信號通路，穩定βcatenin從而異?；罨疻nt信號通路，可能參與HCC的發生發展［20］。由此我們推斷:HBx可能通過直接或間接與β-catenin結合，促使其在細胞漿和細胞核內聚集，影響其轉錄后調控作用，其具體分子機制尚需進一步研究。

本實驗成功構建了一系列HBx N端、C端不同編碼區缺失突變體和融合EGFP的表達載體，該區域涵蓋了已報道的HCC中HBx蛋白自然發生截短突變的主要位點，為深入研究HBx不同缺失突變體的生物學功能及其對Wnt/β-catenin信號通路轉錄活性的影響研究奠定了基礎。

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