梓醇對糖尿病大鼠主動脈的保護作用與抗氧化機制研究*

劉江月

糖尿病大血管病變是糖尿病重要并發癥之一，是糖尿病心腦血管疾病的基礎，已成為糖尿病致死致殘的首要原因，其基本病理變化是動脈粥樣硬化。氧化應激在糖尿病血管病變的發生發展過程中起關鍵作用［1］。梓醇是從地黃塊根中提取的小分子環烯醚萜類化合物［2］，具有降血糖、抗腫瘤、保護神經［3-5］等藥理學作用。多項研究表明［6-8］，梓醇通過調控凋亡蛋白與清除氧化自由基發揮保護心血管組織的功能。目前，關于梓醇是否能夠減輕糖尿病大血管病變，保護大血管國內外尚未見報道。本研究通過高脂飲食誘導Goto-Kakizaki(GK)大鼠主動脈病變模型，從氧化應激角度，以核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)/血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)信號通路為靶點，探討梓醇對糖尿病損傷主動脈的保護作用及其可能機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物與飼料 清潔級雄性6月齡GK大鼠50只及Wistar大鼠10只，體重(220±20)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證為SCXK(滬)2012-0002。普通飼料及高脂飼料(83%普通飼料，15%豬油，1.5%膽固醇，0.5%膽鹽)由濰坊醫學院實驗動物中心提供。

1.2 藥品與試劑 梓醇標準品購于上海銘睿科技有限公司，二甲雙胍購自北京天安制藥股份有限公司，糖化血紅蛋白試劑盒購自上海德賽診斷用品有限公司，血脂試劑盒和血糖試紙均購自羅氏生物技術有限公司，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，Nrf2及HO-1抗體均購自Santa Cruz。

1.3 儀器 AU600型全自動生化分析儀，752型紫外分光光度計，DYCZ-25D型電泳儀，Bio-Rad型濕轉儀，BiospectrumAC凝膠成像分析系統，H-750透射電子顯微鏡。

2 方法

2.1 動物模型建立與分組 50只GK大鼠適應性飼養1周，選取隨機血糖大于11.1 mmol/L以上45只分為糖尿病模型組(B組)、二甲雙胍治療組(C組，100 mg·kg－1·d－1)以及梓醇高劑量治療組(D組，100 mg·kg－1·d－1)、中劑量治療組(E 組，50 mg·kg－1·d－1)、低劑量治療組(F 組，10 mg·kg－1·d－1)，均高脂飼料喂養。10只健康雄性Wistar大鼠作為對照組(A組)，普通飼料喂養。B、C、D、E和F組均在飲水中加入Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)0.1 g·L－1·d－1進行糖尿病大血管病變造模［9］，造模同時灌胃給藥，A、B組給予等量的生理鹽水，造模時間12周。

2.2 標本采集及處理 每4周末尾靜脈取血測FBG。12周末所有大鼠禁食不禁水過夜，10%水合氯醛3 mL·kg－1腹腔注射麻醉，快速取血15 mL，分離血清，－20℃冰箱保存待測各項血清指標。快速取胸主動脈3段，分別置于10%甲醛溶液、預冷的4%戊二醛溶液及液氮中保存備用。

2.3 血清指標檢測 全自動生化分析儀檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG);采用化學熒光法檢測ROS水平，采用硫代巴比妥酸分光光度法檢測MDA和T-AOC水平;采用黃嘌呤氧化酶法間接測定SOD活性;比色法檢測糖基化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin 1c，HbA1c)。

2.4 Western blotting檢測Nrf2和HO-1蛋白表達取液氮保存的胸主動脈段，提取總蛋白，SDS-PAGE分離蛋白后將Nrf2和HO-1蛋白轉移至NC膜上，分別用Nrf2和HO-1羊抗鼠Ⅰ抗4℃孵育過夜，TBST振蕩洗滌3次后，Ⅱ抗37℃孵育1 h，TBST振蕩洗滌4次后，ECL發光顯色，凝膠成像系統掃描分析。

2.5 組織學檢查 取10%甲醛固定的胸主動脈段，石蠟包埋后5 mm切片，HE染色，光鏡下觀察。

2.6 透射電鏡觀察 取4%戊二醛固定的胸主動脈段，1%鋨酸固定、脫水、包埋，超薄切片后3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察胸主動脈壁組織超微結構變化。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 18.0軟件分析，組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 梓醇對GK大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)的影響

在實驗過程中每4周檢測大鼠FBG。結果發現，與A組比較，B組FBG明顯升高(P＜0.05);與B組比較，C、D、E各組FBG均明顯降低(P＜0.05)，C組與D組降糖效果相當，見圖1。

Figure 1.The changes of fasting blood glucose(FBG)in each group.Mean±SD.n=9.#P ＜0.05 vs A group;*P ＜0.05 vs B group.圖1 各組大鼠FBG變化

2 梓醇對GK大鼠HbA1c和血脂的影響

與A組比較，B組HbA1c明顯升高(P＜0.05);與B組比較，C、D、E各組HbA1c均明顯降低(P＜0.05);與 E組比較，D組 HbA1c明顯降低(P＜0.05)而F組HbA1c明顯升高(P＜0.05)，說明梓醇對HbA1c的影響呈明顯劑量依賴性，見圖2。與A組比較，B組TC和TG明顯升高(P＜0.05);與B組比較C、D、E各組TC和TG均明顯降低(P＜0.05);與E組比較，D組TC和TG均明顯降低(P＜0.05)，而F組TC和TG均明顯升高(P＜0.05);與C組比較，D組TC和TG均明顯降低，說明梓醇的降脂效果優于二甲雙胍且呈明顯劑量依賴性，見圖3。

3 梓醇對GK大鼠ROS、MDA、T-AOC及SOD的影響

與A組比較，B組血清ROS和MDA含量明顯升高(P ＜0.01);與 B 組比較，C、D、E 各組血清 ROS、MDA含量均明顯降低(P＜0.01);與C組比較，D組血清ROS和MDA含量均明顯降低(P＜0.01);D、E、F各組血清 ROS和 MDA含量差異顯著(P＜0.01);與A組比較，B組血清T-AOC和SOD活性明顯降低(P＜0.01);與 B組比較，C、D、E 各組血清 TAOC和SOD活性明顯升高(P＜0.01);與C組比較，D組血清T-AOC和SOD活性明顯升高(P＜0.05，P＜0.01);D、E、F各組血清T-AOC和SOD活性差異顯著(P＜0.01)。這些結果說明梓醇具有較強的抗氧化作用，其抗氧化效果優于二甲雙胍且呈明顯劑量依賴性，見表1。

Figure 2.Comparison of HbA1c in each group.Mean ± SD.n=9.#P ＜0.05 vs A group;*P ＜0.05 vs B group;△P ＜0.05 vs E group.圖2 各組大鼠糖化血紅蛋白比較

Figure 3.Serum lipid changes in each group.Mean±SD.n=9.#P ＜0.05 vs A group;*P ＜0.05 vs B group;△P ＜0.05 vs E group;▲P ＜0.05 vs C group.圖3 各組大鼠血脂變化

表1 各組大鼠ROS、MDA、T-AOC及SOD水平Table 1.Levels of ROS，MDA，T-AOC and SOD in each group(Mean ±SD.n=9)

4 梓醇對GK大鼠主動脈組織Nrf2、HO-1蛋白表達的影響

與A組比較，B組大鼠胸主動脈組織Nrf2和HO-1蛋白表達均明顯下調(P＜0.05);與B組比較，C、D、E組大鼠胸主動脈組織Nrf2和HO-1蛋白表達均明顯上調(P＜0.05);與C組比較，D組Nrf2和HO-1蛋白表達均明顯上調(P ＜0.05);D、E、F組Nrf2和HO-1蛋白表達差異顯著(P＜0.05)，說明梓醇可通過激活Nrf2/ARE/HO-1信號通路增強組織抗氧化能力，見圖4、5。

Figure 4.The expression of Nrf2 protein in thoracic aorta tissue in each group.Mean ± SD.n=3.#P ＜ 0.05 vs A group;*P ＜ 0.05 vs B group;△P ＜ 0.05 vs E group;▲P ＜0.05 vs C group.圖4 各組大鼠胸主動脈組織Nrf2蛋白表達

Figure 5.The expression of HO-1 protein in thoracic aorta tissue of each group.Mean ± SD.n=3.#P ＜0.05 vs A group;*P ＜0.05 vs B group;△P ＜0.05 vs E group;▲P ＜0.05 vs C group.圖5 各組大鼠胸主動脈組織HO-1蛋白表達

5 梓醇對GK大鼠主動脈組織的形態學影響

光鏡下觀察到A組大鼠胸主動壁層次清晰，內膜光滑，細胞排列規整;B組可見內膜明顯增厚，大量泡沫細胞堆積;C、D、E組內膜增生明顯減輕，尤其以C組最為明顯，說明梓醇能夠保護GK大鼠主動脈，見圖6。

Figure 6.Thoracic aorta tissue HE staining(×400).圖6 各組大鼠胸主動脈組織HE染色

6 梓醇對GK大鼠主動脈組織超微結構的影響

電鏡觀察發現A組大鼠胸主動脈內皮細胞形態、結構均正常;B組明顯可見空泡大量堆積，細胞損傷明顯;C、D、E組損傷明顯減輕，尤其以C組最為明顯，說明梓醇能夠改善GK大鼠主動脈超微結構的改變，見圖7。

Figure 7.Ultrastructure of aortic endothelial cells under electron microscope(×2 000).圖7 各組大鼠主動脈內皮細胞超微結構

討 論

大血管病變是糖尿病患者最常見慢性并發癥之一，80%糖尿病患者死于大血管病變。研究表明，高血糖、高血脂及氧化應激等諸多因素均參與了糖尿病大血管病變的發生發展［10］。因此，調節糖脂代謝紊亂、減輕或阻斷氧化應激是防治糖尿病大血管病變的重要途徑。地黃在糖尿病治療方面具有悠久的歷史，是治療糖尿病最常用的中藥之一，梓醇是其主要活性成分，具有降低血糖、保護神經等多種藥理學作用。但梓醇對糖尿病大血管病變是否具有保護作用國內外尚未見報道。本研究通過給GK大鼠喂食高脂飲食并在飲水中添加L-NAME，成功復制了糖尿病大血管病變模型［9］。糖尿病大血管病變是血管炎癥和氧化應激導致的［11］，研究［12］證實長期應用 LNAME可以誘導早期的血管炎癥和動脈粥樣硬化，本實驗GK大鼠經高脂飲食聯合飲水攝入L-NAME 12周，B組大鼠胸主動脈出現糖尿病大血管病變典型特征，符合實驗要求。給予梓醇干預治療，病理學檢測顯示，GK大鼠胸主動脈病變明顯減輕，胸主動脈組織超微結構損傷明顯得到改善，表明梓醇能夠減輕2型糖尿病大血管病變，對2型糖尿病主動脈具有保護作用。

陳立等［13］發現，梓醇能調節3T3-L1脂肪細胞糖脂代謝。趙素容等［14］發現，梓醇能顯著降低糖尿病大鼠血糖，調節血脂代謝紊亂。本研究也發現梓醇能夠顯著降低GK大鼠血糖及糖化血紅蛋白，改善血脂代謝紊亂，提示梓醇能夠降低血糖、調節血脂。

Brownlee［15］曾提出了“糖尿病并發癥的統一機制”學說，并指出氧化應激是糖尿病并發癥的共同基礎。在糖尿病機體內，ROS過量產生，抗氧化酶表達不足，氧化/抗氧化系統失調，ROS不能被及時清除而大量蓄積，從而引起氧化應激反應，造成各系統組織細胞損傷［16-17］。眾所周知，ROS和MDA是衡量機體氧化應激水平的主要指標，SOD和T-AOC則是反映機體抗氧化能力的常用指標，因此綜合上述指標可以基本判定機體氧化應激水平。本研究發現，糖尿病血管病變模型組大鼠血清ROS和MDA水平明顯增高，而SOD活性和T-AOC明顯降低，說明氧化應激促進了糖尿病血管病變的發生。Wang等［18］研究發現梓醇能夠減輕糖尿病大鼠氧化應激水平。本研究也發現經梓醇治療后糖尿病大鼠血清ROS和MDA水平顯著降低，而SOD活性和T-AOC明顯升高，說明梓醇能夠降低糖尿病大鼠體內氧化應激水平。

Nrf2是機體氧化應激的感受器，在細胞抗氧化應激中發揮重要作用。在氧化應激狀態下，活化的Nrf2與ARE的特異識別位點相結合，上調下游靶分子SOD、HO-1、γ-GCS等抗氧化酶的表達，增強細胞抗氧化能力，抑制氧化應激反應［19-20］。本研究發現，GK大鼠Nrf2蛋白表達明顯降低并伴有靶分子HO-1表達下調，經梓醇治療后Nrf2蛋白表達明顯增多并伴有靶分子HO-1表達上調，表明梓醇可激活Nrf2/ARE信號通路，增強抗氧化酶HO-1表達，從而抑制糖尿病氧化應激反應。

綜上所述，本研究首次發現梓醇可以減輕糖尿病大血管病變，對糖尿病大血管具有保護作用，這種保護作用與梓醇改善糖尿病糖脂代謝紊亂、激活Nrf2/ARE/HO-1信號通路、減輕糖尿病大血管氧化應激損傷有關。

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