血管生成因子在糖尿病大鼠心肌組織的表達*

陳林林， 桂 春， 韋曉敏， 陳力銓， 朱立光

糖尿病心肌病是一種特異性的心肌病變，其特異性的心肌微血管病變在發病過程中起著重要作用。在糖尿病動物模型發現血管生成因子與糖尿病相關微血管病變的發生與進展密切相關［1-3］。血管生成因子分為兩類:一類是促血管生成因子，包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素1(angiopoietin-1，Ang-1)和血管生成素2(angiopoietin-2，Ang-2);另一類是抑制血管生成因子，包括內皮抑素(endostatin)和血管抑素(angiostatin)，這兩類血管生成因子相互作用參與生理性和病理性血管形成。已有研究證實血管生成正負調節因子的平衡失調與糖尿病腎病、糖尿病視網膜微血管并發癥發生進展有關［2，4］。本研究采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導糖尿病大鼠心肌病模型，檢測 VEGF、Ang-1、Ang-2和 endostatin在心肌組織的表達，從分子水平和組織功能學的角度，探討上述指標與糖尿病大鼠心肌病之間的關系。

材料和方法

1 動物

選取健康清潔級8周齡雄性SD大鼠25只，體重180～220 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，每籠2只，飼養于標準環境，自由進食。

2 主要試劑

STZ(Sigma);多克隆山羊抗 VEGF、Ang-2和GAPDH抗體，HRP標記山羊抗兔IgGⅡ抗，HRP標記兔抗山羊IgGⅡ抗(Santa Cruz);多克隆兔抗Ang-1抗體(PTG);多克隆兔抗endostatin(Abcam);鼠抗人單克隆抗體CD31(北京中杉金橋生物技術有限公司);MaxVision試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司);ECL發光試劑盒(Pierce);血糖儀及血糖試紙(羅氏公司);小動物呼吸機及MPA心功能分析系統(上海奧爾科特生物科技有限公司)。

3 主要方法

3.1 動物分組和模型建立 將大鼠按電腦隨機數法分為正常對照組(control，n=10)和糖尿病組(diabetes mellitus，DM，n=15)。大鼠禁食 12 h，糖尿病組腹腔內注射STZ溶液55 mg/kg，對照組予等量0.1 mmol/L檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。用血糖儀監測鼠尾靜脈血糖，血糖穩定7 d后，以血糖＞16.7 mmol/L并出現多飲、多食、多尿現象的大鼠納入糖尿病組研究，其中成模大鼠13只。實驗過程中糖尿病組死亡3只。死因可能是感染、糖尿病酮癥酸中毒或糖尿病其它并發癥。最終共有20只完成實驗。糖尿病組10只，對照組10只。

3.2 心功能檢測 分別于造模成功后第12周，給予10%水合氯醛麻醉大鼠，行氣管切開插管，接小動物呼吸機，潮氣量1～2 mL/100 g，自左側胸骨旁縱行切開，打開胸腔顯露心尖，將含肝素液導管自心尖向心底方向插入左心室腔內，導管另一頭連接于壓力換能器，導入MPA心功能分析系統記錄左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末期壓力(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室壓力上升最大速率(+dp/dtmax)、左心室壓力下降最大速率(－dp/dtmax)。

3.3 組織標本獲取方法 分別于造模成功后第12周處死大鼠，待檢測完心功能后迅速取出心臟，用冷PBS洗凈，濾紙吸干，稱取并記錄心臟質量，分離心臟左右心室，分別稱量左右心室質量，計算心臟質量/體質量。將心臟標本編號后，一部分心肌組織用4%多聚甲醛固定，備用于Masson染色和CD31免疫組化染色。一部分心肌組織立即置入液氮中保存用于蛋白印記(Western blotting)檢測。

3.4 Masson染色方法 取出經4%多聚甲醛固定的左心室組織，經脫水、透明、浸蠟、包埋后，將石蠟切片至厚5 mm，行Masson染色。在顯微鏡下，膠原纖維呈藍紫色，心肌纖維呈紅色。每個標本選取5個視野，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統分析心肌膠原容積分數(collagen volume fraction，CVF;膠原面積/總面積)。

3.5 左心室組織CD31免疫組化染色 采用Max-Vision兩步法:取左心室中1/3心室組織.經過固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片脫蠟和水化后，組織抗原修復，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶的活性等步驟，加入單克隆抗體CD31在4℃孵育過夜，每張切片加50 μL即用型MaxVision試劑，室溫下孵育15 min，每張滴加100 μL新鮮配制的DAB溶液，沖洗后蘇木素復染。顯微鏡下觀察:凡呈棕色單個內皮細胞或內皮細胞群者均作為1個血管計數，但有平滑肌層及管腔直徑大于20 μm血管排除。計數方法:每張染色切片在低倍鏡下選取毛細血管最高區域，然后在400倍鏡下選擇5個不同的視野，運用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統分析計算毛細血管數與心肌細胞數比值(capillary/myocyte，C/M)。

3.6 左心室組織 VEGF、Ang-1、Ang-2和 endostatin在心肌組織表達的測定 采用Western blotting方法測定大鼠左心室組織 VEGF、Ang-1、endostatin和Ang-2在心肌組織的表達。取適量大鼠左心室心肌約50 mg，液氮研磨后加入RIPA蛋白裂解液(羅氏公司)500 μL和苯甲基磺酰氟5 μL(碧云天生物技術有限公司)提取心肌組織總蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)測定樣本蛋白含量。蛋白經SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉印至PVDF膜，剪出目的條帶，室溫封閉1 h，Ⅰ抗孵育過夜，洗膜10 min，共3次，Ⅱ抗室溫孵育1 h，洗膜后在暗房用ECL發光試劑盒顯影。用Quantity One成像系統進行蛋白條帶的灰度值分析。以目的條帶與內參照GAPDH條帶的灰度值比值來代表目標蛋白的相對表達量，分析結果。

4 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用兩樣本均數比較t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 2組大鼠同期血糖及體重比較

與對照組比較，糖尿病大鼠隨機血糖濃度明顯高于對照組(P＜0.01);造模后大鼠體重較對照組比較明顯下降，第4、8和12周時體重顯著低于對照組(P ＜0.01)，見表1。

表1 對照組與糖尿病組大鼠隨機血糖和體重變化Table 1.Changes of random plasma glucose and body weight in control and diabetic rats(Mean±SD.n=10)

2 2組心臟血流動力學及心功能的比較

與對照組比較，糖尿病組LVEDP明顯增高(P＜0.01)，而 +dp/dtmax和 － dp/dtmax明顯下降(P ＜0.05);左室收縮末壓略有所下降，但差別無統計學意義(P＞0.05);2組心率比較，差別無統計學意義，見圖1、表2。

Figure 1.The changes of LVP and ±dp/dtmaxbetween control group and DM group.A:the changes of LVP in control group;B:the changes of LVP in DM group;C:the changes of±dp/dtmaxin control group;D:the changes of±dp/dtmaxin DM group.圖1 2組大鼠心臟左心室壓力變化及左室內壓最大上升和下降速率圖

表2 2組大鼠心臟血流動力學指標比較Table 2.The changes of HR，LVSP，LVEDP，+dp/dtmaxand－dp/dtmaxin control and diabetic rats(Mean±SD.n=10)

3 2組大鼠心肌組織Masson染色比較

正常大鼠心肌組織經Masson染色，在光鏡下未見間質及微血管纖維化，而糖尿病組光鏡下見心肌細胞空泡變，心肌間質和微血管纖維化明顯，膠原纖維相互連接成網狀結構，排列紊亂，分布不均，呈天藍色(見圖2箭頭標志)。計算心肌CVF發現，糖尿病組心肌CVF較正常組比較明顯增多，差別有統計學意義(14.59% ±3.36%vs 2.58% ±0.39%，P ＜0.01)，見圖2。

Figure 2.Masson staining of left ventricular myocardial tissues(×100).A:control group;B:DM group.圖2 2組大鼠左心室心肌組織的Masson染色圖

4 2組左心室組織CD31免疫組化染色結果

與正常大鼠心肌組織比較，DM組大鼠心肌組織毛細血管稀疏，計算心肌C/M值較正常組比較明顯降低，差別有統計學意義(0.50±0.12 vs 0.43 ±0.11，P ＜0.01)，見圖3。

5 2組左心室組織 VEGF、Ang-1、Ang-2和 endostatin在心肌組織的表達

Figure 3.Immunohistochemical staining of CD31 in left ventricular myocardial tissues(MaxVision method，× 400).Red arrows indicate CD31 positive in capillary endothelial cells.A:control group;B:DM group.圖3 2組大鼠左心室組織CD31免疫組化染色圖

與正常對照組比較，糖尿病組大鼠心肌組織表達 VEGF(0.74 ± 0.10 vs 0.44 ± 0.07)和 Ang-1(0.49±0.06 vs 0.18 ±0.05)明 顯 降 低 (均 P ＜0.05);endostatin較正常對照組表達明顯增高(0.49 ±0.10 vs 0.66 ±0.16 ，P ＜0.05);而 Ang-2 無明顯差異(0.54 ±0.12 vs 0.61 ±0.09，P ＞0.05)，見圖4。

Figure 4.The expression of Ang-1，VEGF，Ang-2 and endostatin in myocardium detected by Western blotting.Mean ± SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖4 2組大鼠左心室心肌組織VEGF、Ang-1、Ang-2和endostatin的表達

討 論

糖尿病性心肌病是一種特異性心肌病，為糖尿病的嚴重慢性并發癥之一，其典型病理改變為心肌細胞肥大，心肌間質增生及纖維化、心肌局灶性壞死、心肌微血管數目減少等。本研究以鏈脲佐菌素腹腔注射建立動物模型，Masson染色顯示膠原含量較正常組明顯增加，提示心肌間質組織出現纖維化;CD31免疫組化顯示C/M比值明顯減低，反映相對心肌毛細血管數減少;心臟血流動力學顯示左室收縮、舒張功能均減退，提示本實驗已經成功建立了糖尿病心肌病的動物模型。

糖尿病心肌微血管病變在糖尿病心肌病的進展過程起著重要作用，揣測微血管病變與心肌組織局部促血管生成因子和抑制血管生成因子失衡有關。VEGF是最主要的始動促血管生成因子，促進內皮細胞的增殖、遷移、分化啟動血管的生成［5］。Sasso等［6］發現在糖尿病合并冠心病患者心肌中VEGF表達減少，其作用機制可能是通過抑制PI3K/Akt通路使心肌微血管形成受限，心肌血管密度減低，側枝血管形成受限。Ang-1是一個重要的血管穩定因子，通過對血管平滑肌的招募，促進新生血管的成熟，在血管生成后期血管重構、成熟和穩定發揮著重要作用［7］。研究表明Ang-1/Tie-2信號通路下調，顯著減弱小鼠對血管平滑肌細胞的招募，新生血管成熟受限，表現為血管功能和結構異常，如通透性增高，血管彎曲變形和不成熟［8］。而上調Ang-1信號通路，可以改善缺血心肌的微血管數目，促進血管生成［9］。Ang-1與VEGF協同參與生理和病理性血管形成，過度VEGF干預誘導不成熟血管的生成，表現為血管通透性增高，組織水腫，而Ang-1能促進新生血管的成熟穩定，能有效逆轉單一VEGF所引起的血管滲漏［8，10-11］。Shin 等［12］在體外臍帶靜脈內皮細胞培養及小鼠下肢缺血模型發現，單獨的Ang-1并不能有效的增加毛細血管的密度，聯合應用Ang-1和VEGF促進成熟穩定的血管形成，改善缺血組織局部血流灌注。本實驗發現與對照組比較，糖尿病大鼠心肌組織Ang-1和VEGF表達明顯下調，提示在糖尿病心肌微血管數目下降與VEGF和Ang-1在心肌組織下調有關，與文獻報道一致。

Ang-2是血管生成素家族另一成員，是Ang-1的天然拮抗劑，其競爭結合Tie-2，阻礙Ang-1/Tie-2磷酸化信號轉導，拮抗Ang-1的血管穩定作用［13］;另一方面在VEGF缺乏時，Ang-2促使內皮的凋亡，血管退化，血管數目減少，而在VEGF增加時，協同發揮促血管生成作用［4］。有研究表明早期Ang-2的過表達加上持續的Ang-1表達能促進毛細血管密度增加，有效增加缺血小鼠下肢血流灌注，單一的Ang-1或Ang-2均不能形成成熟穩定的血管，提示這種平衡失調導致新生血管形成受限［14］。本次研究發現Ang-2無明顯變化，而VEGF和Ang-1顯著減低，推測可能相對Ang-2增高而VEGF不足及Ang-1/Ang-2比例下調，這種比例失調導致血管生成障礙，參與糖尿病心肌病微血管病的進展。

Endostatin是一種具有潛在抗血管生成的因子，由MMP-2、MMP-9和組織蛋白酶L催化降解膠原XⅧ而產生，其具體的抗血管生成機制不明。有研究表明endostatin在糖尿病患者動脈血管中表達明顯增高，可能與其上調MMP-2和MMP-9表達有關［15］。Sodha等［16］研究表明血清 endostatin水平與糖尿病冠心病患者側支循環的建立呈負相關，而與糖尿病患者血糖水平呈正相關。本次研究發現內皮抑素在糖尿病心肌組織表達上調，可能是長期的高血糖，導致胰島素抵抗，晚期糖基化終產物等刺激血管平滑肌細胞、內皮細胞分泌MMP-2和MMP-9，水解膠原XⅧ增多，從而上調endostatin的表達。

綜上所述，糖尿病心肌微血管病變與心肌組織促血管生成因子VEGF和Ang-1表達減少、抗血管生成因子endostatin過度表達有關。VEGF降低使血管生成的啟動受限，Ang-1下調導致血管成熟發育功能障礙，而過度表達的內皮抑素進一步抑制了血管生成，使血管結構和功能異常。同時相對Ang-1/Ang-2比例失調影響糖尿病心肌血管生成。總之，這2類正負血管生成因子的平衡失調，導致糖尿病微血管功能障礙，可能是糖尿病心肌病產生的重要機制。

［1］ Pfister F，Wang Y，Schreiter K，et al.Retinal overexpression of angiopoietin-2 mimics diabetic retinopathy and enhances vascular damages in hyperglycemia［J］.Acta Diabetol，2010，47(1):59-64.

［2］ Ichinose K，Maeshima Y，Yamamoto Y，et al.Antiangiogenic endostatin peptide ameliorates renal alterations in the early stage of a type 1 diabetic nephropathy model［J］.Diabetes，2005，54(10):2891-2903.

［3］ 田河林，韋立順，許忠新，等.糖尿病小鼠腎小球微血管密度與VEGF表達的研究［J］.中國病理生理雜志，2012，28(2):358-361.

［4］ Peters S，Cree IA，Alexander R，et al.Angiopoietin modulation of vascular endothelial growth factor:effects on retinal endothelial cell permeability ［J］.Cytokine，2007，40(2):144-150.

［5］ Tomanek RJ，Holifield JS，Reiter RS，et al.Role of VEGF family members and receptors in coronary vessel formation［J］.Dev Dyn，2002，225(3):233-240.

［6］ Sasso FC，Torella D，Carbonara O，et al.Increased vascular endothelial growth factor expression but impaired vascular endothelial growth factor receptor signaling in the myocardium of type 2 diabetic patients with chronic coronary heart disease ［J］.J Am Coll Cardiol，2005，46(5):827-834.

［7］ Kobayashi H，Debusk LM，Babichev YO，et al.Hepatocyte growth factor mediates angiopoietin-induced smooth muscle cell recruitment［J］.Blood，2006，108(4):1260-1266.

［8］ Chen JX，Stinnett A.Disruption of Ang-1/Tie-2 signaling contributes to the impaired myocardial vascular maturation and angiogenesis in type II diabetic mice［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28(9):1606-1613.

［9］ Chen JX，Stinnett A.Ang-1 gene therapy inhibits hypoxiainduciblefactor-1α (HIF-1α )-prolyl-4-hydroxylase-2，stabilizes HIF-1α expression，and normalizes immature vasculature in db/db mice ［J］.Diabetes，2008，57(12):3335-3343.

［10］ Kupatt C，Hinkel R，Pfosser A，et al.Cotransfection of vascular endothelial growth factor-A and platelet-derived growth factor-B via recombinant adeno-associated virus resolves chronic ischemic malperfusion:role of vessel maturation［J］.J Am Coll Cardiol，2010，56(5):414-422.

［11］ Smith AH，Kuliszewski MA，Liao C，et al.Sustained improvement in perfusion and flow reserve after temporally separated delivery of vascular endothelial growth factor and angiopoietin-1 plasmid deoxyribonucleic acid［J］.J Am Coll Cardiol，2012，59(14):1320-1328.

［12］ Shin SH，Lee J，Ahn DG，et al.Co-delivery of vascular endothelial growth factor and Angiopoietin-1 using injectable microsphere/hydrogel hybrid systems for therapeutic angiogenesis［J］.Pharm Res，2013，30(8):2157-2165.

［13］Reiss Y，Droste J，Heil M，et al.Angiopoietin-2 impairs revascularization after limb ischemia ［J］.Circ Res，2007，101(1):88-96.

［14］ Qin D，Trenkwalder T，Lee S，et al.Early vessel destabilization mediated by angiopoietin-2 and subsequent vessel maturation via angiopoietin-1 induce functional neovasculature after ischemia ［J］.PLoS One，2013，8(4):e61831.

［15］Chung AW，Hsiang YN，Matzke LA，et al.Reduced expression of vascular endothelial growth factor paralleled with the increased angiostatin expression resulting from the upregulated activities of matrix metalloproteinase-2 and-9 in human type 2 diabetic arterial vasculature［J］.Circ Res，2006，99(2):140-148.

［16］ Sodha NR，Clements RT，Boodhwani M，et al.Endostatin and angiostatin are increased in diabetic patients with coronary artery disease and associated with impaired coronary collateral formation［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296(2):H428-H434.