張玉婕， 閆承慧， 朱 男， 張效林， 趙 昕， 韓雅玲

高血壓是由多個環境因素和遺傳因素相互作用的結果［1-2］，在環境因素和遺傳基因共同影響下，已經成為影響全球三分之一成人的嚴重公共衛生問題和沉重負擔。鹽作為高血壓發病的主要環境因素之一，始終備受人們關注。

大量的證據顯示高血壓與氧化應激相關［3-5］，氧化應激產物促使內皮功能紊亂［6-7］和血管損傷［8］。在血管中的活性氧誘導內皮功能紊亂、血管平滑肌增殖、收縮性增加、脂質氧化、單核細胞浸潤、炎癥和基質蛋白聚集，導致血管改變，最終形成高血壓血管病［9-10］。

在基礎［11］和臨床［12］研究中顯示高鹽飲食能夠增加氧化應激，在鹽敏感高血壓個體中尤為明顯。即使在鹽負荷后血壓沒有顯著提高，鹽敏感性依然可以引起靶器官(例如心臟和腎臟)結構和功能的損害［13］。除了對心臟和腎臟的影響，高鹽也能夠誘導非血壓依賴的動脈血管結構和功能的改變［14］，例如胸主動脈、頸動脈、股動脈和腸系膜上動脈等血管改變，但目前尚無高鹽對冠狀動脈影響的相關研究。

既往研究證實高鹽攝入能夠導致心血管損害，補鉀能夠抑制這種損害［15］。例如，高鹽攝入能夠降低Dahl鹽敏感高血壓大鼠的生存率，而補鉀能夠緩解鹽誘導的生存率降低，這很可能與補鉀對心血管的保護作用相關［16-17］。Ma等［18-19］指出髙鉀攝入能夠抑制多種血管損傷模型中新生內膜的形成，例如球囊損傷后的大鼠頸動脈及豬冠狀動脈。此外，飲食鉀不僅能夠降低血壓，還能夠抑制血管平滑肌細胞的增殖［20］和遷移［21］，但飲食鉀對血管保護的調節因素還沒有被闡明。本研究探討高鹽攝入能否引起冠狀動脈結構和功能的改變，以及補鉀后能否緩解高鹽引起的冠狀動脈結構和功能的改變。

材料和方法

1 材料

抗內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和gp91多克隆抗體均購自Sigma;一氧化氮測試盒及丙二醛(malondialdehyde，MDA)測試盒購自南京建成生物工程有限公司;二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)熒光探針及辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗購自中杉金橋生物公司;蛋白印跡發光試劑購自Amersham。

2 方法

2.1 動物分組 取4周齡SD大鼠30只，隨機分為正常對照組(NS)、高鹽組(HS)和高鹽補鉀組(HS+HP)，每組各10只。正常對照組給予蒸餾水，高鹽組給予含1.5%NaCl的蒸餾水，高鹽補鉀組給予含1.5%NaCl和0.5%KCl的蒸餾水，各組均干預16周。實驗終止前1 d，將SD大鼠置于新陳代謝籠中，搜集24 h尿液用于分析尿鈉。實驗終止時，10% 水

合氯醛經腹腔注射麻醉動物。分離左側頸動脈周圍組織，剪斷左側頸總動脈并采血。開胸后分離心臟用于形態學和免疫熒光染色分析。

2.2 各組SD大鼠血壓的測定 將大鼠放入固定器內，全身加熱。加熱溫度設置在37℃。將加壓尾套套在鼠尾合適的位置。大鼠適應環境約10 min后，測量收縮壓，連測3次，取其平均值作為一個測量值。所有測量均是在下午進行，以減少因生理節律造成的波動。

2.3 HE染色觀察各組大鼠冠狀動脈的改變 將標本在3% 多聚甲醛中固定4 h，PBS清洗，然后置于7.5% 蔗糖PBS溶液4℃過夜;將心臟切為每段1 cm，固定于OTC中;置于冰凍切片機中，切片厚度為5 μm;進行HE染色。血管圖像分析:在光鏡下觀察冠狀動脈的形態。在20倍和63倍物鏡下將完整的血管橫切面HE染色圖像攝入計算機圖像分析系統中。用Image-Pro Plus 6.0分析冠脈動脈管壁厚度、管壁面積/管腔面積的比。

2.4 免疫熒光染色觀察各組大鼠冠狀動脈的eNOS表達 取不同組中SD大鼠的心臟，行冰凍切片，進行eNOS免疫熒光染色。PBS溶液沖洗3次，每次5 min;山羊血清封閉1 h，阻斷非特異性著色;每張切片滴Ⅰ抗(稀釋倍數 1∶100)30 μL，4 ℃過夜;PBS 溶液沖洗3次，每次5 min;室溫下熒光標記Ⅱ抗孵育2 h;PBS溶液沖洗3次，每次5 min;DAPI染核5～8 s;PBS溶液沖洗3次，每次5 min;用封片液進行封片;熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2.5 DHE熒光探針染色 染液稀釋后濃度為10 μmol/L，滴定到冰凍切片上30 μL，37℃避光孵育10 min;孵育結束后，用新鮮溶液清洗冰凍切片;顯微鏡下觀察，拍照。

2.6 Western blotting檢測gp91在大鼠冠狀動脈的表達 采用BCA比色法測量大鼠冠狀動脈提取物中蛋白的濃度，使各組中蛋白濃度相一致，用Eppendorf管分裝，每管40 μL在－80℃冰箱中凍存;樣品在8%或10%分離膠中行SDS-PAGE電泳，每條泳道上樣25 μL;轉膜;5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;TBS-T洗膜5次，每次10 min;加入Ⅰ抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜;TBS-T洗膜5次，每次10 min;加入Ⅱ抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h;TBS-T洗膜5次，每次10 min;進行顯色，膠片曝光成像。

2.7 硝酸還原酶法測定大鼠血清中NO水平 收集各組大鼠血清，采用硝酸還原酶法，按試劑盒說明書操作，測定標準品和樣品的540 nm波長的吸光度值，按公式［NO含量(μmol/L)=(測定管吸光度－空白管吸光度)/(標準管吸光度－空白管吸光度)×標準品濃度×樣本測試前稀釋倍數］計算血清中NO的代謝產物NOx－(包括 NO3－和NO2－)含量，以此代表NO的產量，其中樣品具有復孔，添加2次，取均值。

2.8 硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法測定大鼠血清中MDA的水平 收集各組大鼠血清，采用TBA法，按試劑盒說明書操作，測定標準品和樣品的540 nm波長的吸光度值，按公式［血清中MDA含量(μmol/L)=(測定管吸光度－空白管吸光度)/(標準管吸光度－空白管吸光度)×標準品濃度×樣本測試前稀釋倍數］計算血清中MDA含量，其中樣品具有復孔，添加2次，取均值。

3 統計學處理

計量資料用均數±標準誤(mean±SEM)表示，用SPSS 17.0統計軟件對各組數據進行正態性及方差齊性檢驗，然后用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 高鹽攝入誘導SD大鼠血壓升高及冠狀動脈重塑

在HS組中，大鼠血鈉和尿鈉較NS組大鼠顯著升高(P＜0.05)，見表1。提示鹽負荷成功。鹽負荷16周HS組中約70%的大鼠血壓顯著升高，根據HS組SD大鼠血壓分布情況將其分為鹽敏感大鼠和鹽抵抗大鼠，其中鹽敏感大鼠為后續實驗中的HS組大鼠;鹽抵抗大鼠因實驗過程中血壓無明顯升高，在本實驗中被剔除，用于其它研究。

表1 各組大鼠的數據比較Table 1.Compiled data of the animals with different treatments(Mean±SEM.n=5)

如圖1A所示，隨著鹽負荷時間的延長，HS組大鼠的血壓逐漸升高，鹽負荷5周前血壓較正常組無明顯差異，鹽負荷6周后血壓較正常組顯著增加。4周血壓增加至(120.1±3.3)mmHg，處于高血壓前期I級;10周以后血壓顯著增加至(131.2±3.8)mmHg，為高血壓前期II級。鹽負荷16周時，HS組SD大鼠收縮壓為(135.7±2.9)mmHg，較正常組SD大鼠收縮壓顯著增加29 mmHg(P＜0.05)，見圖1B。

如圖1C所示，鹽負荷16周時，HS組較NS組SD大鼠的冠狀動脈管壁厚度及管壁面積與管腔面積比顯著增加(P＜0.05)，可見高鹽攝入能夠誘導SD大鼠血壓升高及冠狀動脈重塑。

2 高鹽誘導SD大鼠冠狀動脈氧化應激增加及內皮細胞損傷

鹽負荷16周時大鼠冠狀動脈內超氧陰離子較對照組明顯增多，MDA含量顯著增加，且冠狀動脈內gp91的表達顯著增加，見圖2。這提示高鹽誘導SD大鼠冠狀動脈氧化應激增加。

圖3顯示鹽負荷后大鼠冠狀動脈內皮eNOS表達較對照組顯著降低，且血清中NO含量顯著降低，提示高鹽能夠誘導SD大鼠冠狀動脈內皮細胞損傷。

3 補鉀緩解高鹽誘導的SD大鼠血壓增加和冠狀動脈重塑

鹽負荷的同時給予補鉀治療，HS+HP組與HS組比大鼠的血鈉沒有顯著差異，但HS+HP組與HS組比大鼠的血鉀顯著增高(P＜0.05)，提示補鉀成功。補鉀后可以顯著降低高鹽攝入誘導的SD大鼠血壓的升高［(114.6 ±4.2)mmHg vs(135.7 ±2.9)mmHg，P ＜0.05］，見圖1A、B。補鉀除了可以顯著降低血壓外，還可以緩解高鹽誘導SD大鼠冠狀動脈重塑［管壁厚度:(21.2 ±1.8)μm vs(30.9 ±2.5)μm，P ＜0.05;管壁面積/管腔面積比:0.195 ±0.008 vs 0.271 ±0.017，P ＜0.01］，見圖 1C。與此同時，補鉀可以緩解高鹽誘導SD大鼠血清中NO含量的降低和MDA水平的增加，見圖2、3。DHE熒光探針染色結果顯示，HS組與其它組比，冠狀動脈中超氧陰離子顯著增加，HS+HP組可以緩解由鹽負荷引起的超氧陰離子增加，見圖2。

Figure 1.Long-term high salt loading results of the hypertension and the coronary remodeling in salt-loaded rats.A:systolic blood pressure(SBP)monitoring every 2 weeks;B:SBP in the 3 groups after 16-week salt loading;C:HE staining of the coronary artery sections and quantitative analysis of the media thickness and the ratio of coronary artery wall to lumen.Scale bars:50 μm.Mean ± SEM.n=5.*P ＜0.05 vs NS.圖1 鹽負荷后大鼠血壓升高及冠狀動脈重塑

討 論

本研究證實高鹽攝入不僅能引起血壓升高，還能引起冠狀動脈結構和功能的改變，誘導氧化應激增多及內皮細胞損傷，補鉀后通過降低氧化應激來緩解高鹽引起的有害效應。

既往的研究報道表明，短期高鹽飲食并不引起SD大鼠血壓的變化［21-22］，然而長期高鹽飲食可以誘導SD大鼠血壓升高［23-25］。在本實驗中，我們發現長期高鹽攝入可以誘導大部分SD大鼠(70%)血壓升高。高鹽干預1～5周時，高鹽組大鼠與正常組大鼠血壓無明顯差異，與既往研究相一致，短期高鹽攝入并不影響SD大鼠血壓的改變。高鹽干預第6周時，大鼠血壓開始升高，并隨著高鹽干預時間的延長，血壓進一步升高。補鉀后可以緩解由高鹽攝入引起的大鼠血壓的升高。

Figure 2.Oxidative stress detected in coronary arteries of salt-loaded rats.A:DHE staining for superoxide anion production in coronary arteries at 16 weeks;B:gp91 expression detected by Western blotting;C:serum MDA content detected by thiobarbituric acid method.Scale bars:50 μm.Mean ± SEM.n=5.*P ＜0.05 vs NS.圖2 鹽負荷后大鼠冠狀動脈氧化應激增加

已有人群研究證實，長期高鹽飲食可以引起炎癥、氧化應激、血管內皮功能障礙、腎損傷、腎臟細胞因子基因表達的改變等，進而引起高血壓［26］。長期高鹽飲食不但可以引起血壓的升高，也可以誘導血管結構發生改變［27］。短期高鹽飲食時，并不引起血管結構的改變，但長期高鹽飲食時，會發生血管結構的改變，如頸動脈、腸系膜上動脈等，然而，目前尚不清楚是否長期高鹽攝入可以引起SD大鼠冠狀動脈結構和功能的改變。本研究證實，長期高鹽攝入可以引起冠狀動脈重塑，管壁厚度和管壁面積/管腔面積比顯著增加。補鉀后可以緩解由高鹽誘導SD大鼠冠狀動脈重塑。氧化應激在高血壓的發生、發展中發揮著重要作用。高血壓動物模型可見血管出現氧化應激，降低血管氧化應激或減少活性氧的產生，可以降低血壓［28］。臨床研究表明，高血壓與血管氧化應激密切相關，給予抗高血壓藥物可以降低氧化應激的產生。氧化應激主要通過損傷內皮細胞，降低NO釋放量，從而減少其血管舒張的作用［29］。在本研究中，長期高鹽飲食誘導SD大鼠血鈉增加，內皮損傷(血清中NO含量降低，冠狀動脈eNOS表達下降)，產生氧化應激(血清中MDA含量顯著增加，DHE熒光探針染色發現高鹽組大鼠冠狀動脈內超氧陰離子增加，Western blotting發現高鹽組大鼠冠脈內gp91表達增加)。綜上所述，長期高鹽飲食，通過激活氧化應激，損傷內皮細胞，減少NO釋放量，引起高血壓。

既往的研究表明，補鉀飲食(含2.1%KCl鼠糧)飼養大鼠，其24 h尿鉀含量較正常對照組顯著增加，提示補鉀成功。標準鼠糧含1.1%KCl，根據大鼠每日飲食量及飲水量估算補鉀飲水干預需含0.5%KCl的蒸餾水飼養大鼠，故本研究采用含0.5%KCl的蒸餾水干預大鼠［30］。NADPH氧化酶是血管內生成活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的主要酶體，在外來信號刺激下激活或失活，從而迅速升高或降低細胞內的ROS水平。gp91是NADPH氧化酶的活性亞單位，在電子轉移和活性氧族生成中發揮著重要作用。在本研究中，發現補鉀后能夠降低高鹽干預后大鼠冠狀動脈內gp91的表達，從而降低NADPH氧化酶的活性來減少氧化應激的生成，進而改善高鹽引起的內皮損傷(大鼠血清中NO水平和冠狀動脈內eNOS表達恢復正常水平)，起到保護冠狀動脈的作用。

本研究提示，建議人們改善生活方式，限制鹽飲食并多吃富含鉀的蔬菜水果，有助于血壓的降低和血管結構及功能的保護，減少心血管疾病的發生率及其危害。

(致謝:真誠感謝沈陽軍區總醫院指導老師在查閱文獻、實驗設計及論文寫作方面提供的幫助。)

Figure 3.Endothelium damage detected in coronary arteries of salt-loaded rats.A:immunofluorescence staining for eNOS expression in coronary arteries;B:serum NO level detected by nitrate reductase method.Scale bars:50 μm.Mean ± SEM.n=5.*P ＜0.05 vs NS.圖3 鹽負荷誘導大鼠冠狀動脈內皮細胞損傷

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