星星草PtGAPDH基因的克隆與表達分析

張旸，郭海俊，劉龍飚，王卅，梁穎，聶玉哲，李玉花*

(1.東北林業大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國石油天然氣管道工程有限公司天津設計院，天津 300457)

星星草(Puccinelliatenuiflora)俗稱堿茅，屬多年生旱中生鹽生草本植物，廣泛分布在我國北方和世界大部分地區，具有適應性強、耐旱、耐寒、耐鹽堿等特性，是一種較好的改良鹽堿化土壤的先鋒植物[1]。該植物的根系發達，具有較強的耐鹽堿能力，在生理上通過滲透調節作用減輕鹽堿對細胞膜的損害，利用有限的水分散失獲取最大的CO2同化量，降低氣孔導度、延緩蒸騰作用以適應鹽堿脅迫下吸水困難的特性[2]。在分子水平上，通過構建星星草cDNA文庫及芯片雜交的方法，已獲得部分與耐鹽堿特性相關的高豐度表達基因[3]，包括離子和水分轉運、細胞代謝和防御、信號轉導與轉錄調控等方面。

目前在星星草抗鹽堿特性分子機制的研究中，已經獲得采用NaHCO3脅迫的模擬鹽堿環境中的星星草基因表達譜，并通過差異顯示技術獲得了多個差異表達的基因片段[4]。

在從星星草中分離出的相關抗鹽堿基因中，如HKT2[5]，GAPDH等基因都是其中重要的基因之一，而GAPDH編碼的蛋白(GAPDH)是高等植物糖酵解過程中的關鍵酶，是維持生命活動能量形成的基本酶類之一[6]，參與基因表達的轉錄后控制，作用于核tRNA運輸、DNA復制與修復等過程，以及調控組蛋白基因的表達、調節端粒結構等[7-8]。此外， GAPDH通過抑制活性氧積累[9]、激活MAPK級聯反應[10]等途徑及多種修飾作用[11-12]參與多種生理過程，具有抵抗逆境脅迫的功能。然而，關于GAPDH參與植物逆境脅迫響應的機制還需進一步深入研究。

本研究以星星草為試材，采用cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends， RACE)的方法克隆星星草GAPDH基因，并對其在鹽堿脅迫下的表達情況進行了分析，為在分子水平上研究星星草的耐鹽堿機制、深入了解星星草GAPDH基因的功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

星星草種子來源于2008年5月份返堿期在黑龍江省青岡縣(東經126°06″，北緯46°41″)天然鹽堿地(pH 9.5)草場，采摘后于2010年種于溫室，栽培基質采用草炭土∶珍珠巖∶蛭石=3∶2∶1，溫度25℃，光照強度為400 μmol/(m2·s)，相對濕度65%～75%，生長到8周齡時用0，50，100，150和200 mmol/L Na2CO3分別處理24 h后取其地上部分，每組同時取3次樣，用于實驗重復，然后用液氮速凍，于-80℃保存備用。在此基礎上，采用200 mmol/L Na2CO3分別處理0，2，6，12，24，48和72 h，將草的葉片和根部剪下，每組同時取3次樣用于實驗重復，用液氮速凍，于-80℃冰箱保存備用。

1.2 RNA提取與RACE庫構建

采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的方法提取星星草地上部總RNA，滅菌去離子水溶解RNA，利用NanoDrop1000微量紫外分光光度計測量樣品的OD260和 OD280比值及濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。利用mRNA Purification Kit(購自Amersham Biosciences公司)對星星草RNA進行純化，然后利用MarathonTMcDNA Amplification Kit (購自BD Biosciences公司)構建星星草RACE cDNA庫，最后利用RACE cDNA庫進行基因克隆。

星星草GAPDH基因克隆及Northern 雜交探針引物通過PrimerPrimer 5軟件設計，并由上海生物工程有限公司進行合成。引物序列見表1。

1.3 星星草GAPDH基因克隆及序列測定

表1 星星草GAPDH基因同源克隆及表達分析所用引物Table 1 List of primers used for cloning and expression analysis of GAPDH from P. tenuiflora

對星星草GAPDH基因3′序列的克隆，根據星星草抑制性消減雜交文庫中GAPDH基因的EST序列(GeneBank登錄號GW405820)，設計2條3′RACE上游引物GSP3′1和GSP3′2，然后以RACE cDNA庫為模板進行巢式PCR擴增。第一輪PCR反應引物采用GSP3′1及AP1，反應程序為94℃ 2 min；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循環；72℃，7 min。第二輪PCR反應引物采用GSP3′2及AP2，反應程序為94℃ 2 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個循環；72℃，7 min。

對于星星草GAPDH基因5′序列的克隆，根據星星草GAPDH基因片段，設計2條5′RACE上游引物GSP5′1和GSP5′2。然后以RACE cDNA庫為模板進行巢式PCR擴增。第一輪PCR反應引物采用GSP5′1及AP1，反應程序為94℃ 2 min；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循環；72℃，7 min。第二輪PCR反應引物采用GSP5′2及AP2，反應程序為94℃ 2 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個循環；72℃，7 min。

對于克隆得到星星草GAPDH3′和5′的基因片段測序并拼接，并在NCBI網站上利用ORF(open reading frame finder)預測氨基酸序列，并根據ORF兩端序列設計特異引物GAPDH-LF和 GAPDH-LR擴增GAPDH基因的編碼區。反應程序為94℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循環；72℃，7 min。

將所有PCR產物利用天根公司的膠回收試劑盒對電泳后產物進行回收純化，并與天根公司的pBS-T TA載體進行連接，轉化到TaKaRa公司Top10大腸桿菌感受態細胞中，提取重組質粒，質粒經過PCR鑒定后送北京六合華大基因進行測序。

1.4 序列比對及系統發育分析

為了明確所克隆基因在生物信息學中的進化地位，將所得序列與EMBL/DDBJ/GenBank數據庫中序列進行BLAST 檢索比對，獲得與所克隆序列高度相似的同源基因序列，使用ClustalX1.83軟件進行堿基序列比對，使用GeneDoc軟件進行氨基酸序列比對分析及保守域的信息標注；使用NCBI提供的ORF-finder與保守區數據庫(conserved domain database，CDD)分別進行基因開放閱讀框分析與蛋白保守結構域分析，并將克隆所得堿基序列按照標準遺傳密碼子的翻譯方式轉換為氨基酸序列。使用ExPASY軟件計算蛋白的理論分子量、等電點、不穩定系數等參數；使用ProtScale預測和分析蛋白質的疏水性/親水性。利用SignalP 3.0(或4.0)Server 程序預測信號肽結構。用MEGA 4軟件的鄰位相連法(neighbor-joining，NJ)構建系統樹。參數設定1000個抽樣重復進行Bootstrap驗證，泊松校驗(Poisson Correction)作為計算距離的方法。

1.5 星星草PtGAPDH基因的表達分析

利用CTAB試劑提取經不同濃度Na2CO3(0，50，100，150，200 mmol/L)處理及不同處理時間(0，2，6，12，24，48，72 h)的星星草地上部及根部樣品總RNA；分別取10 μg總RNA樣品進行1.0%的甲醛瓊脂糖變性凝膠電泳，并轉移到Hybond-N+尼龍膜上，65℃預雜交1 h，使用地高辛標記的GAPDH特異探針(探針引物GAPDH-NF及NR，探針長度300 bp)雜交1 h，顯影，通過Northern雜交檢測GAPDH基因在不同處理條件下的表達量變化。

2 結果與分析

2.1 星星草GAPDH基因全長cDNA序列的克隆及序列比對

根據星星草GAPDH基因的EST序列，設計GAPDH基因的3′端和5′端基因特異引物，利用構建的星星草RACE cDNA庫，分別克隆得到基因3′端(241 bp)和5′端(953 bp)，經過拼接得到1300 bp全長基因序列(圖1)。去除該基因的3′端非編碼區和5′端非編碼區，該基因CDS長為1014 bp，包含1個編碼337個氨基酸的開放閱讀框。將此基因序列及其推導的氨基酸序列在NCBI的數據庫中進行Blastn和Blastp比對分析，該基因與大麥(Hordeumvulgare)、小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)等植物的GAPDH基因具有極高的相似性，因而將該基因片段命名為PtGAPDH，GenBank登錄號為JX411954。該基因編碼蛋白的預測分子量為36.5 kDa，理論等電點(pI)為6.40，負電荷殘基總數(Asp+Glu)為41，正電荷殘基總數(Arg+Lys)為39，不穩定系數為23.17，屬于穩定蛋白；親水性(grand average of hydropathicity，GRAVY)值為-0.068，說明此蛋白屬于親水蛋白。信號肽預測表明，PtGAPDH基因編碼的蛋白無信號肽結構，為非分泌性蛋白(non-secretory protein)。

圖1 PCR產物檢測Fig.1 The PCR amplification results of PtGAPDHM：DL2000標記； A：3′ PCR產物；B：5′ PCR產物；C：CDS產物。M：DL2000 marker；A：3′ PCR product；B：5′ PCR product；C：CDS product.

利用NCBI的蛋白保守區數據庫(CDD)對PtGAPDH蛋白進行蛋白保守區預測。結果顯示，PtGAPDH基因編碼的蛋白具有2個保守區，分別是Gp_dh_ N末端(Gp_dh_N superfamily) 和Gd_ph_C末端超家族 (Gd_ph_C superfamily)。結合已有報道，如毛竹(Phyllostachyspubescens)GAPDH蛋白[12]為糖酵解和糖異生的關鍵酶，也具有2個保守的結構域：其中保守區的C端為Gd_ph_C α螺旋和反平行β折疊的混合結構，是行使糖運輸和糖代謝的催化功能域；另一個保守區是Gd_ph_N，為NAD+結合功能域(圖2)，由此類比表明PtGAPDH蛋白具有高度的保守性。

PtGAPDH與其他近緣物種GAPDH蛋白質的多重氨基酸序列比對結果表明，星星草PtGAPDH基因編碼的氨基酸序列與其他近源物種的GAPDH蛋白均具有較高的相似性，相似度約在87%～97%之間，其中與禾本科植物高羊茅(Festucaarundinacea)、大麥、小麥、水稻的相似性最高，分別為97%，96%，95%和91%，顯示了GAPDH基因在物種進化過程中的保守性；MEME-Motif分析表明在PtGAPDH蛋白的第135～142個氨基酸位置以及第314～322個氨基酸位置分別含有2個保守的基序結構，推測其與GAPDH作為甘油醛-3-磷酸脫氫酶在糖酵解中行使的功能相關(圖3)。

2.2 PtGAPDH與其他近緣物種的GAPDH基因的系統發育關系

為了確定PtGAPDH基因的系統發生位置，從EMBL/DDBJ/GenBank數據庫中選取16個近源物種的GAPDH基因的序列信息來構建系統發生樹。圖4顯示了系統發生樹構建的結果，星星草PtGAPDH基因編碼蛋白與單子葉植物的GAPDH為同一起源，并與高羊茅的同源性最高，在進化上屬于同一類分支。

圖2 PtGAPDH基因編碼蛋白的氨基酸保守區Fig.2 The conserved domain of PtGAPDH Gp_dh_N superfamily: 甘油醛3-磷酸脫氫酶，N端結構域。Gp_dh_C superfamily: 甘油醛3-磷酸脫氫酶，C端結構域。PLN02358: 甘油醛3-磷酸脫氫酶。

圖3 不同植物來源的GAPDH氨基酸序列多重比對Fig.3 Comparison of the amino acid sequences of GAPDH in different plants

續圖3 不同植物來源的GAPDH氨基酸序列多重比對Continue Fig.3 Comparison of the amino acid sequences of GAPDH in different plants PtGAPDH (GeneBank登錄號Accession number, JX411954)：星星草Puccinellia tenuiflora; TmGAPDH (GeneBank登錄號Accession number, AY857765)：一粒小麥Triticum monococcum; ZmGAPDH (GeneBank登錄號Accession number, EU963991)：玉米Zea mays; SiGAPDH (GeneBank登錄號Accession number, XM_004972916)：小米Setaria italica; LtGAPDH (GeneBank登錄號Accession number, EU328533)：毒麥Lolium temulentum; FaGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, GQ480772)：高羊茅Festuca arundinacea; HvAK359500(GeneBank登錄號Accession number, AK359500)：大麥芽Hordeum vulgare; OsGAPDH (GeneBank登錄號Accession number, GQ848049)：水稻Oryza sativa; TaGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, FN429985)：小麥Triticum aestivum; HvGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, X60343)：大麥芽Hordeum vulgare; BdGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, XM_003573276)：二穗短柄草Brochypodium distachyon; PsGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, DQ922680)：西伯利亞蓼Polygonum sibiricum; AlGAPDH (GeneBank登錄號Accession number, JN604531)：獐草Aeluropus lagopoides; PpGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, AB826123)：沙梨Pyurs pyrifolia.

2.3 鹽堿脅迫下PtGAPDH基因的表達分析

為了檢測星星草PtGAPDH基因與鹽堿逆境的應答關系，利用Na2CO3溶液模擬鹽堿脅迫，對星星草PtGAPDH基因的表達特性進行Northern雜交檢測。采用不同濃度的Na2CO3溶液對星星草植株進行處理，圖5所示的Northern雜交結果表明，50～200 mmol/L Na2CO3溶液處理24 h后植株地上部PtGAPDH基因的表達量均比對照組未處理的植株樣品有不同程度的增加，且200 mmol/L Na2CO3處理后表達量處于較高的穩定水平。

選擇200 mmol/L Na2CO3溶液對星星草進行處理，并進行時間梯度的表達分析。圖6和圖7所示的結果表明，植株地上部及根部PtGAPDH對Na2CO3處理后的脅迫均具響應。在星星草的葉片中，PtGAPDH基因在無鹽堿處理的樣品(0 h)中幾乎沒有表達，在鹽堿處理2和6 h后表達量增加；但在處理12 h時，表達量又有所下降；當處理24 h時表達量又上升且達到最高，在處理48及72 h后表達量又回落，呈逐漸下降趨勢。在根部中，PtGAPDH基因在無鹽堿脅迫處理時幾乎不表達，在2 h后開始出現表達豐度，且表達量緩慢升高，在24 h后表達量達到最大值，但在48及72 h后表達量又有所回落，呈逐漸下降趨勢。表明一定濃度的鹽堿脅迫誘導PtGAPDH基因的高豐度表達，但是當脅迫程度(包括脅迫時間和濃度)超過可承受范圍后，星星草樣品的生理生化機制發生變化，PtGAPDH基因的表達、應答通路受到干擾，導致其表達量回落到低水平。

圖4 PtGAPDH進化樹分析Fig.4 Phylogenic analysis of PtGAPDH in various plant species PtGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, JX411954)：星星草Puccinellia tenuiflora; AtGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, NP-17280)：擬南芥Arabidopsis thaliana; AcGAPDH (GeneBank登錄號Accession number, ADQ43814)：菠蘿Ananas comosus; StGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, ABB72804)：馬鈴薯Solanum tuberosum; PpGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, EMJ23673)：碧桃Prunus persica; MtGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, XP-003601828)：蒺藜苜蓿Medicago truncatula; OsGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, NP-001053139)：水稻Oryza sativa; TaGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, ABQ81648)：小麥Triticum aestivum; HvGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, BAJ90709)：大麥Hordeum vulgare; SlGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, XP-004239181)：番茄Solanum lycopersicum; FaGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, ACV86034)：高羊茅Festuca arundinacea; AmGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, CAA42103)：金魚草Antirrhium majus; LcGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, AEO72143)：荔枝Litchi chinensis; VvGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, XP_002263145)：葡萄Vitis vinifera; ThGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, BAJ33926)：鹽芥Thellungiella halophila; SdGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, AEO45785)：野甘草Scoparia dulcis; ZmGAPDH(GeneBank登錄號Accession number, ADZ55283)：玉米Zea mays.

圖5 不同濃度Na2CO3處理后PtGAPDH基因的表達Fig.5 PtGAPDH expression after different Na2CO3 concentration stress

圖6 200 mmol/L Na2CO3處理不同時間后星星草葉片PtGAPDH基因的表達Fig.6 PtGAPDH expression after time gradient stress with 200 mmol/L Na2CO3 in leaf

3 討論

圖7 200 mmol/L Na2CO3處理不同時間后星星草根部PtGAPDH基因的表達Fig.7 PtGAPDH expression after time gradient stress with 200 mmol/L Na2CO3 in root

在植物的抗鹽生理研究中，先前多以NaCl為研究對象。然而在自然界的鹽害脅迫中，除了NaCl外，以Na2CO3為主的堿性鹽也對植物產生重要影響。鹽、堿2種脅迫機理有著明顯的不同，但較NaCl產生的鹽脅迫而言，Na2CO3帶來的堿脅迫由于其能夠提高土壤的pH值，因而具有更大的生態破壞力。本研究以Na2CO3脅迫下的星星草為研究對象，對挖掘該植物的抗逆潛力，揭示其抗性特點，討論其耐鹽堿機理具有重要意義。研究表明星星草對鹽脅迫的耐受強度要高于堿脅迫[13]。處理結束時，NaCl脅迫的最高存活濃度為600 mmol/L，而Na2CO3的處理濃度超過200 mmol/L時即導致死亡。并且NaCl對植株產生的影響比較緩慢，而Na2CO3在處理濃度大于100 mmol/L后脅迫效應會明顯加劇，使植物體的生長狀態發生明顯變化，植物體內的一些滲透調節物質如脯氨酸等的積累量大幅升高[14]， 細胞內Na+含量較NaCl處理的植物體有顯著提高。而且與羊草(Leymuschinensis)具有相似的生長適應策略及Na+、K+代謝響應[15]。尹尚軍等[16]研究指出，星星草的各種脅變指標的最大變化多發生在Na2CO3濃度為150 mmol/L時，本實驗結果表明星星草在Na2CO3脅迫條件下的致死濃度為200 mmol/L，因此在研究不同濃度鹽堿脅迫對星星草抗逆基因表達的影響中設計5個特定濃度，即：0，50，100，150和200 mmol/L。此外，本研究中選取8周齡的星星草作為試材的原因是因為星星草的草齡一般在4個月左右，而8周齡正好是該草的生理成熟期，在該時間段上基因的表達和一些生理指標呈現穩定趨勢，受外界環境的影響較小。而太老或太嫩的植株會在各種數據上產生波動，不宜揭示植物耐鹽堿特性。

植物在經受鹽堿脅迫的過程中，隨著鹽堿濃度的增加，細胞膜的透性增強，對離子的選擇性吸收減弱，從而使細胞內積累大量Na+，保證細胞內外的滲透平衡。同時，鹽堿脅迫會導致植物體內一些代謝副產物的累積，如活性氧。Baek 等[17]將GAPDH基因轉化到擬南芥原生質體中， 發現該基因能強烈抑制熱脅迫時H2O2的產生和細胞的死亡。而PtGAPDH就是該抗氧化系統中的重要酶類。隨著對甘油醛-3-磷酸脫氫酶研究的不斷深入，已發現許多植物GAPDH基因可被多種環境脅迫所誘導，說明GAPDH基因的表達可能增強了植物抵抗這些脅迫的能力。崔麗蓉等[18]對小麥進行脅迫處理后發現GAPDH基因被誘導，表達量迅速增加，進而強化其抵御環境變化的脅迫。于麗麗等[19]利用PEG、NaCl及CdCl2處理誘導檉柳(Tamarix)，發現ThGAPDH基因在根中的表達上升，但抑制其在莖和葉中的表達，而NaHCO3處理均能誘導該基因在根、莖、葉中的表達。在本項研究中，鹽堿脅迫處理會導致PtGAPDH基因的高量表達。同時從各部分雜交結果體現的趨勢來看，對于星星草的葉片和根部，該基因在表達量上存在差異。

對星星草在不同濃度的鹽堿脅迫下的PtGAPDH基因的表達情況進行研究發現，在Na2CO3脅迫的致死濃度范圍內，不同濃度的Na2CO3脅迫對基因的表達并沒有太大影響，說明不同程度的脅迫都會引起該基因的表達，但在表達量上卻沒有太大的差異。雖然在對關于不同濃度鹽堿脅迫處理的Northern雜交試驗中不能得到PtGAPDH基因表達量上的線性變化規律，但從Na2CO3在處理濃度大于100 mmol/L后脅迫效應會明顯加劇這一現象中可以推測，不同濃度鹽堿脅迫對星星草生理指標的脅迫作用要強于基因表達方面對其的影響。因此展開星星草不同濃度鹽堿脅迫下生理指標的研究是進一步探討抗逆植物耐鹽堿機制的良好途徑。

PtGAPDH基因在沒有鹽堿脅迫條件下，無論是葉片還是根部均幾乎不表達。葉片在6和24 h鹽堿脅迫處理后表達量達到最大值，其余的處理時間段上該基因都呈現弱的表達狀態。而根部在24 h處理后達到高峰，在48 h處理后表達量呈下降趨勢，表明該基因在24 h左右對脅迫的響應最大，而且在植物不同的部位，基因雖一直持續對脅迫做出響應，但對脅迫的響應程度是有差異的。這可能是由于植株不同組織部位的滲透調節作用不同，含水量以及無機離子和有機滲透調節物質的積累量也不同，所以葉片和根部在對脅迫的響應上可能存在時間和空間上的差異。抗逆基因的表達量在鹽堿脅迫下的規律性變化可以反應抗逆植株在抵御逆境脅迫過程中基因的表達規律，為進一步深入地探討植物耐鹽堿機理奠定了理論基礎。