高效穩定纖維素分解菌群篩選及其分解特性研究

王得武，姚拓，楊巧麗，韓華雯，張英，盧虎，滾雙寶*

(1.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州 730070)

纖維素是地球上分布最廣、含量最豐富的可再生資源，廣泛存在于園林、秸稈、畜禽糞便等有機固體廢棄物中[1-3]，但這些資源的利用率極低，目前僅有約11%被用于造紙、燃料、飼料、生產農作物產品和建筑等方面，剩余的絕大多數在自然界中被微生物降解轉化，最終生成CO2和H2O，構成了生態系統中碳循環的一個重要環節，但從人類利用自然能源的角度來看，這卻是一個巨大的浪費[4-5]，同時還派生了一系列的生態和環境問題。利用微生物技術是實現這些纖維素資源能源化、肥料化及解決相關環境問題的一種有效途徑。目前應用和研究的纖維素分解菌多為單菌株，工業生產纖維素酶的微生物菌種大多都是絲狀真菌，然而單菌株往往存在纖維素酶系不夠完整[6]、酶活不穩定、酶作用pH范圍狹窄及產酶成本高等問題[7]，纖維素分解能力有限。自然界中，纖維素在多種微生物共同作用下被分解從而進入碳素循環。因此，微生物群體功能的研究越來越受到關注[2,7-11]。如崔宗均等[8]利用限制性培養技術和優化組合方法，篩選馴化了一組高效而穩定的纖維素分解復合菌系MC1，該復合菌系的分解能力遠遠高于純培養的單個菌株，并能夠有效的分解經化學處理的木質纖維素材料[8-9]，王偉東等[2]篩選的復合菌系WSC-6具有與MC1類似的高效分解特性[2,10]，但這兩組復合系屬于高溫菌群(50℃左右)，常溫條件下應用受到一定的限制。

本研究以森林腐殖質、腐爛的玉米秸稈、牛場料槽旁土樣、麥垛底部土樣和牛雞糞混合儲糞池中土樣為原材料，篩選出了一組常溫條件能高效降解纖維素的微生物群體，并對該菌群的木質纖維素分解能力、不同酸堿條件下的纖維素分解能力及其菌株組成特性進行了研究，以期為其進一步研究與推廣應用提供理論依據與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種來源 森林腐殖質、腐爛的玉米秸稈、牛場料槽旁土樣、麥垛底部土樣和牛雞糞混合儲糞池中土樣。

1.1.2培養基[12]蛋白胨5 g，酵母膏5 g，纖維素(新華濾紙)5 g，NaCl 5 g，CaCO32 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.5 mg，MnSO4·H2O 0.16 mg，ZnSO4·7H2O 0.16 mg，CoCl20.2 mg，加蒸餾水至1000 mL，pH 7.0，121℃滅菌25 min。

1.1.3纖維材料 濾紙(大小為2 cm×6 cm)以1%醋酸浸泡過夜后，用蒸餾水反復浸泡洗至中性，80℃烘干備用。秸稈和木屑粉碎過1 mm篩，蒸餾水煮沸10 min，以3層沙布過濾沖洗，80℃烘干恒重后備用。

1.2 方法

1.2.1纖維素分解菌群的篩選 于2011年10月-2012年1月，取篩選所用材料(見1.1.1)各5 g，分別接入100 mL培養基內培養(試驗設6個重復)，命名為第1代，待培養液中濾紙分解至不再明顯變化，取菌液5 mL接入新鮮培養基(見1.1.2)，命名為第2代，重復接種，依次為3，4，……，n代,根據濾紙條的斷裂程度判斷降解效果：(+)濾紙邊緣膨脹；(++)為濾紙邊緣不定形；(+++)濾紙整體不定形；(++++)濾紙成團糊狀；(+++++)濾紙完全成糊狀。培養條件：28～32℃，80 r/min微震。

1.2.2纖維素分解菌群對不同纖維材料分解能力的測定 分別以0.5 g的濾紙、玉米秸稈、稻草秸稈、小麥秸稈、柞木木屑和楊木木屑為培養基唯一碳源(不含原培養基中的碳源)制作100 mL培養基，接種5 mL纖維素分解菌群，培養條件同1.2.1，6 d后利用失重法測定不同纖維材料的分解量(失重量)，計算分解率(失重率)，具體方法如下：參考測定飼料粗纖維使用的尼龍袋技術[13]及測定土壤纖維分解強度使用的尼龍網袋法[14]，利用38 μm尼龍袋過濾培養基，再用大量蒸餾水沖洗，80℃烘干，恒重，計算。纖維材料分解率=(纖維材料原質量+尼龍袋質量-烘干后纖維材料與尼龍袋質量和)/纖維材料原質量×100%。

1.2.3不同初始pH值下纖維素分解菌群對濾紙分解效果的測定 以濾紙為培養基唯一碳源制作100 mL培養基，將培養基初始pH值調至5，6，7，8，9，10和11，分別接種5 mL纖維素分解菌群，培養條件同1.2.1，每隔12 h測定培養基pH值，并觀察培養基濾紙崩解的情況，待培養基pH值穩定后測定濾紙分解量，計算分解率，測定方法同1.2.2。

1.2.4纖維素分解菌群單菌株的分離及菌株組合對濾紙分解能力的測定 培養基加入1.5%的瓊脂制作固體培養基，取纖維素分解菌群用生理鹽水稀釋至10-5，10-6，10-7分別涂平板。將涂好的平板放入32℃培養箱內培養3 d，培養好氧菌；將涂好的平板裝入厭氧袋，真空抽氣1 min，再充氮氣1 min，反復操作3次，將厭氧袋封口，置于32℃培養箱內5 d，培養兼性厭氧菌。根據平板培養基上菌落形態差異，多次劃線分離直至純化為單菌，對分離的單菌株相互組合接入以濾紙為唯一碳源的培養基，培養6 d測定濾紙的分解率，測定方法同1.2.2。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2003軟件對數據進行處理和繪圖，采用SPSS 18.0統計分析軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 纖維素分解菌群的篩選

由表1可以看出，以森林腐殖質、腐爛的玉米秸稈、牛場料槽旁土樣、麥垛底部土樣作為原材料，傳代過程中培養基中濾紙有變軟、邊緣崩解跡象，但始終不能徹底分解濾紙，至第10代，淘汰以上述材料篩選的菌群。

從牛、雞糞混合儲糞池中的土樣篩選的菌群，第1代培養基中濾紙240 h完全崩解，第2代培養基中濾紙120 h完全崩解，第3代培養基中濾紙72 h完全崩解，從第6代以后，濾紙崩解時間逐步穩定到48 h左右，經過30代培養，獲得了一組高效、穩定的纖維素分解菌群(圖1)。

2.2 纖維素分解菌群對不同纖維材料分解力

分解率與絕對分解量是反映菌群分解潛力的重要指標。纖維材料不同，分解強度差異較大。纖維素分解菌群6 d分解濾紙0.47 g，分解率達94.95%，顯著高于其他纖維材料的分解量及分解率；對秸稈的分解能力居中，6 d分解率為45%左右；對柞木木屑和楊木木屑分解率則較低，6 d分解率分別為11.00%和1.22%(表2)。表明纖維素分解菌群對純纖維素材料的分解能力極強，對秸稈類木質纖維素材料具有較高的分解能力，但對木材類木質纖維原料分解能力較差。

表1 不同材料所篩菌群對濾紙的分解效果Table 1 Filter paper decomposition of isolated microbial community from different materials

2.3 不同初始pH值下纖維素分解菌群對濾紙的分解效果

圖1 不同代纖維素分解菌群對濾紙的分解效果Fig.1 Effects of different culture times on filter paper decomposition in cellulose microbial community 圖中標注時間為濾紙崩解成糊狀所需時間。The marked time in figure were the degradation time of filter paper into paste completely.

分別對初始pH為5～11的培養基接種后，24 h培養液的pH為8左右，之后的84 h內pH值在7.5～9.2范圍內輕微波動，108 h后最終穩定在8.5～8.8之間(圖2)，表明纖維素分解菌群在初始pH為5～11的條件下適應能力極強，能夠快速調節并穩定反應體系pH值。

由表3可以看出，濾紙分解率與濾紙崩解時間變化較為一致，濾紙崩解所需時間越短，濾紙分解率越高。初始pH 7～10條件下，濾紙48 h被分解為糊狀，6 d分解0.47～0.48 g，分解率達94.37%～95.26%，表明纖維素分解菌群能夠適應該酸堿條件并在該條件下具有極強的纖維素分解能力。初始pH為5，10和11的條件下，菌群能夠將反應體系pH迅速調節至正常范圍內，雖然濾紙崩解時間明顯延長，濾紙分解率降低，但仍高達84.59%，表明該酸堿條件對菌群分解能力有一定的影響，但仍具有較強的纖維素分解能力。

結合圖2、表3發現，濾紙崩解前培養液pH值波動較大，濾紙完全崩解后，培養基pH值平緩變化，反應體系pH值的變化在一定程度上反映了纖維素分解菌群對纖維素的降解程度。

2.4 纖維素分解菌群單菌株分離及菌株組合對濾紙的分解能力

纖維素分解菌群經過平板分離培養，得到一系列形態特征明顯的菌落，對各個菌落在同樣的培養條件下劃線分離純化，得到8株真菌、6株細菌和3株放線菌，對這17株單菌以不同的方式相互組合(表4)接種培養6 d，發現濾紙分解率均低于1.25%，而纖維素分解菌群6 d對濾紙的分解率高達94.95%(表2)，表明分離得到的菌株幾乎不具備纖維素分解能力，說明纖維素分解菌群中含有傳統的平板培養分離方法不能獲得的菌株，且未分離到的菌株在纖維素降解過程中起關鍵性作用，同時表明纖維素分解菌群具有菌種組成多樣性和作用機理復雜性的特點。

表2 纖維素菌群對濾紙、秸稈、木屑的分解能力Table 2 Degradation activity of filter paper, straw, and sawdust by cellulose composite microbial strains

注：表中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Different lowercase in the table mean significant difference at 0.05 level. The same below.

圖2 不同初始pH值條件下pH值變化曲線Fig.2 pH changes with incubation time in different initial pH values

3 討論

3.1 纖維素分解菌群的篩選

森林腐殖質、堆放腐爛的玉米秸稈等材料中含有大量的纖維素分解菌，但可能由于其菌源采集環境與篩選所用培養基營養條件差異太大，部分纖維素分解菌難以通過人工篩選獲得。長期堆放牛糞和雞糞的儲糞池中纖維素原料、粗蛋白及微生物和酶所需的磷、鉀、鋅、銅等元素含量豐富[15]，纖維素分解菌富集，且該條件下營養狀況與本研究篩選所用培養基營養條件較為相近，更有利于纖維素分解菌的篩選。微生物降解纖維素是酶催化的過程，纖維素完全降解成葡萄糖至少需要多種功能不同的但又互補的纖維素酶組分協同作用才能完成[16]。同一種菌株產生所需全部酶類且活性都很高的幾率并不大，而且效率較低。本研究通過連續傳代培養，篩選優勢菌群，強化菌株之間的協同作用，同時也是對菌群酶系優化的過程，有針對性地篩選出能產生高效復合酶的專用型復合菌群，這與研究者們提出的通過對纖維素酶酶系組分的重建構從而優化降解酶系， 提高對纖維素底物的降解效率的策略相一致[17]。纖維素分解菌群能夠在48 h左右將濾紙分解成糊狀，也證明了其分解纖維素的高效性。此外，經過30代培養篩選的菌群本身就是一個微生態系統，菌株個體之間協同作用強，形成一個有機整體，功能穩定、抵抗外界環境能力強，具有較高的實際應用價值。

表3 不同初始pH值條件下對濾紙分解Table 3 Decrease of filter paper in different initial pH value

表4 菌株不同組配方式下對濾紙的分解能力Table 4 The decomposition ability of bacterial strains to filter paper in the different combinations

3.2 纖維素分解菌群對不同纖維材料分解力

纖維材料的木質素的含量、比表面積、結晶度及聚合度等因素是影響微生物降解纖維素材料的主要影響因素。濾紙是聚合度和結晶度都居中等的純纖維材料，纖維素分解菌群對其分解強度極高，6 d分解率達94.95%。秸稈和木材等木質纖維素材料細胞壁化學成分主要包括纖維素、半纖維素和木質素，其結構復雜，性質穩定[18]，自然條件下降解極為困難。有報道表明，纖維素酶、半纖維素酶及附屬酶(包括脫支酶、酚酸酯酶)，以及木質素降解與修飾酶等酶是降解天然細胞材料的必需組分[4]，對未經處理的小麥秸稈粉、稻草秸稈粉及玉米秸稈粉在纖維素酶過量(100 UFPA)條件下酶解48 h，酶解率均低于10%[19]，可見僅依靠纖維素酶無法完成對天然植物原料細胞壁中纖維素的降解。本研究篩選的纖維素分解菌群常溫條件下對不做化學處理的玉米秸稈、稻草秸稈、小麥秸稈6 d分解率分別達48.52%，45.05%和44.30%，表明纖維素分解菌群產生了降解木質纖維的部分酶系，能夠高效的降解玉米秸稈等木質纖維素材料，因此，該菌群在秸稈等農業廢棄資源利用等領域具有一定的開發利用價值，對促進農業循環經濟有積極的意義[20]。纖維素分解菌群對木材纖維原料分解率較低，木材原料不同，其分解率差異較大，對堅硬沉重的柞木分解率為11.00%，而對較為輕柔的楊木分解率僅為1.22%，這可能與木材結構的復雜程度及木質素含量有關。

3.3 不同初始pH值下纖維素分解菌群對濾紙的分解效果

pH值是反映一個反應體系穩定性的重要指標，在纖維素分解菌的發酵液中pH值的不穩定是抑制纖維素分解活性的主要原因之一[10]。本研究對初始pH值為5～11的培養基中接入纖維素分解菌群培養6 d，反應體系pH值最終調節并穩定在8.0～8.8之間，表明纖維素分解菌群pH值適應及調節能力極強，這與崔宗均等[8]篩選的復合系MC1和復合系WSC-6有類似的pH值調節特性[10]，不同之處是復合系MC1和復合系WSC-6的pH變化曲線較為平緩，本研究篩選的菌群pH調節過程則呈波動的方式，且pH值曲線的波動與濾紙的分解效果存在一定的相關性，其原理目前尚不清楚，還需要進一步研究。此外本研究篩選的纖維素分解菌群中性條件下對濾紙的分解率為95%左右，稍低于復合系WSC-6在中性條件下對濾紙的分解率[10]，但在堿性條件對纖維素的分解具有明顯優勢。

3.4 纖維素分解菌群單菌株分離及菌株組合對纖維素的分解能力

自然界中，多種菌株構成的微生物菌群能夠分解很多難分解的物質，這些微生物只有在一起才具備分解某種物質的功能，生存環境發生改變或缺少其中某一種或某幾種微生物后，整個微生物群的分解能力會下降，甚至功能喪失。另外，這些微生物群落中各個菌種之間存在協同作用并相互依存，各菌種對環境要求苛刻，大部分都無法通過實驗室分離培養，常規的平板分離技術只能得到很小的一部分信息。本研究篩選的纖維素分解菌群能夠高效分解纖維素，利用平板技術對該菌群分離得到的17株單菌相互組合，發現人工組合的菌群不具備纖維素分解能力，說明纖維素分解菌群中含有傳統平板培養分離方法不能獲得的菌株，且未分離到的菌株在纖維素降解過程中起關鍵性作用，推斷分離得到的菌株可能是纖維素分解菌，但所產酶系不健全，不具備纖維素分解能力；或是纖維素分解菌的伴生菌[21]，雖然不能分解纖維素，但能夠利用纖維素分解產生的糖類物質，減小糖類物質對后續反應的抑制，對纖維素的分解起促進作用[22]。因此，纖維素分解菌群的菌種組成及其菌間關系還待于進一步的研究。

4 結論

1)本研究篩選出了纖維素分解能力強且功能穩定的纖維素分解菌群。2)篩選出的纖維素分解菌群能夠高效分解秸稈類木質纖維材料，為秸稈等天然木質纖維原料的資源化利用提供了一定的理論依據。另外，該菌群還具有較強的酸堿適應及調節能力。3)對纖維素分解菌群進行分離、純化得到的真菌、細菌和放線菌以不同方式相互組配，構建的人工菌群不具備纖維素分解能力。