流感病毒裂解疫苗無菌檢查法的建立

北京市藥品檢驗所（100035）王似錦 高春

疫苗免疫仍然是當今預防流感最有效的手段。國際標準的流感疫苗證明安全有效[1]。流感疫苗是最早進行核酸疫苗研究的一種疫苗[2]。流感病毒裂解疫苗是用世界衛生組織（WHO）推薦的、并經國務院藥品管理部門批準的甲型和乙型流行性感冒（簡稱流感）病毒株分別接種雞胚，經培養、收獲病毒、病毒活化，純化、裂解后制成[3]。

裂解型流感滅活疫苗是建立在流感全病毒滅活疫苗的基礎上，通過選擇適當的裂解劑和裂解條件裂解流感病毒，去除病毒核酸和大分子蛋白，保留抗原有效成分HA和NA以及部分M蛋白和NP蛋白，經過不同的聲場工藝取出裂解劑和純化有效成風制備而成。目前使用的裂解劑主要包括乙醚、3-N-丁基磷酸鹽（Tri-N-butyl phosphate）、聚山梨酯80（Polysothat 80）、脫氧膽酸鈉（Sodiumdeoxyholate）及三硝基甲苯X100（TritoX100）等，裂解型流感疫苗可降低全病毒滅活疫苗的接種副反應，并保持相對較高的免疫原性，可擴大疫苗的使用范圍，但在制備過程中須添加和去除裂解劑[4]。

中國藥典2010年版三部附錄[5]要求，只要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法，并要求進行方法學驗證。當建立產品的無菌檢查法時，應進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該產品的無菌檢查。流感病毒裂解疫苗含硫柳汞防腐劑，在無菌檢查過程中，該防腐劑的殘留有可能導致加入的驗證菌株無法生長，從而導致無菌檢查法的驗證失敗[6]。本研究用硫代硫酸鈉作為中和劑，該中和劑能夠成功的消除硫柳汞防腐劑的抑菌作用，從而建立了流感病毒裂解疫苗的無菌檢查法，現將筆者的研究總結報告如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設備 HTY無菌隔離器（杭州泰林生物技術設備有限公司）；HTY-2000A集菌儀（杭州泰林生物技術設備有限公司）；一次性使用的全封閉三聯集菌培養器KDGB330（杭州泰林生物技術設備有限公司）；生化培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。

1.2 樣品 本試驗所用樣品為流感病毒裂解疫苗（批號：20110604，規格：0.5ml/支），由北京天壇生物制品股份有限公司生產。

1.3 試劑和培養基 0.1%蛋白胨水溶液、硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基均按照中國藥典2010年版三部附錄[5]ⅫA無菌檢查法項下要求配制及滅菌。0.1mol/L的硫代硫酸鈉溶液：取硫代硫酸鈉26g與無水碳酸鈉0.20g，加新沸過的冷水適量使溶解，并稀釋至1000ml，搖勻，濾過，分裝，滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時間為30min。

附表 流感病毒裂解疫苗無菌檢查法驗證試驗結果

1.4 菌種 本試驗所用菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、大腸埃希菌（Escherichia coli） [CMCC（B）44 102]、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64 941]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F） 98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法

2.1 菌液制備 按照中國藥典2010年三部附錄[5]ⅫA無菌檢查法項下對照菌液配置，菌液濃度10～100CFU/ml。

2.2 試驗方法 取樣品20支，全部轉移至稀釋液（0.1%蛋白胨水溶液或0.1mol/L的硫代硫酸鈉溶液）100ml中，作為供試液；取一次性全封閉集菌培養器（三聯），先用沖洗液（0.1%無菌蛋白胨水溶液）潤濕濾膜，將上述供試液全部通過3個濾器，濾干后用沖洗液沖洗，沖洗1次，每次每膜100ml。過濾后，2個濾器加入硫乙醇酸鹽流體培養基各100ml，另1個濾器加改良馬丁培養基100ml。分別加入6種驗證菌株（10～100CFU），硫乙醇酸鹽流體培養基的濾器置35℃培養，改良馬丁培養基置25℃培養，觀察驗證菌生長情況。

3 結果與討論

分別采用2種稀釋液的無菌檢查方法學驗證結果見附表所示。采用0.1%蛋白胨水溶液作為稀釋液，4種細菌均生長良好，而加入的白色念珠菌和黑曲霉未生長。采用0.1mol/L的硫代硫酸鈉溶液作為稀釋液，4種細菌和2種真菌均生長良好。細菌在使用兩種稀釋液的情況下均能夠生長良好，分析原因可能是硫乙醇酸鹽流體培養基中含有硫乙醇酸鈉，該鈉鹽能夠中和汞類防腐劑硫柳汞[7]。而白色念珠菌和黑曲霉所用的培養基是改良馬丁培養基，該培養基中沒有能夠中和汞類防腐劑的成分，因此，需要使用0.1mol/L的硫代硫酸鈉溶液作為中和劑，以便消除該疫苗樣品中的硫柳汞防腐劑的抑菌作用，從而使白色念珠菌和黑曲霉在培養72h后能夠生長良好。

4 結論

流感裂解滅活疫苗是在全病毒顆粒疫苗的基礎上，采用適當方法將流感病毒顆粒裂解，保留其有效抗原，去除易引起副反應的成分。有研究表明，流感病毒表面的HA在流感病毒感染過程中起著重要作用，其抗體是一種保護性抗體；同時神經氨酸酶抗體具有抑制流感病毒再感染的功能，所以也具有一定的保護作用；而病毒中的類脂成分和病毒顆粒內部的蛋白不但對抗體產生顯著作用，還易引起接種副反應。裂解劑的作用是裂解病毒核酸和大分子蛋白，保留其抗原的有效成分。但裂解劑濃度過高或作用時間過長均會使血凝素（HA）發生斷裂，影響疫苗抗原性，因此裂解劑的選擇及作用條件非常重要。

利用硫代硫酸鈉作為中和劑，能夠消除流感病毒裂解疫苗中所含的硫柳汞防腐劑的抑菌作用，建立該產品的無菌檢查法為：取本品20支，全部轉移至0.1mol/L的硫代硫酸鈉溶液100ml中，經薄膜過濾法處理，用0.1%蛋白胨水溶液分次沖洗（每膜不少于100ml），以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，其余操作依照中國藥典2010年三部附錄[5]ⅫA無菌檢查法進行，應符合規定。