p16、p53和Ki67在宮頸癌中的表達(dá)及其臨床意義

雷 蕾，葉 斌，王西川

(成都市第六人民醫(yī)院 a.腫瘤科，b.病理科，四川 成都 610051)

宮頸癌是一種發(fā)生在子宮頸上皮的惡性腫瘤，也是全球婦女中僅次于乳腺癌的第二個(gè)最常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國(guó)居女性生殖道惡性腫瘤第一位，發(fā)病年齡高峰為40～60歲。宮頸癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類型是鱗狀細(xì)胞癌，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但現(xiàn)有的研究表明宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是由宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)到浸潤(rùn)癌的連續(xù)發(fā)展過(guò)程［1］，是多種癌基因和抑癌基因的表達(dá)、調(diào)控以及細(xì)胞凋亡參與的多步驟的復(fù)雜過(guò)程［2］。p16是一種新型抑癌基因，參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的周期調(diào)控。p53基因是重要的抑瘤基因，分為野生和突變兩種亞型，是細(xì)胞增生的主要負(fù)調(diào)控子，該基因的突變或缺失是導(dǎo)致許多腫瘤發(fā)生的原因。Ki67是一種細(xì)胞增殖核抗原，其表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)宮頸炎和宮頸癌組織中p16、p53蛋白和Ki67表達(dá)情況，以探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院婦產(chǎn)科2007年4月至2013年10月宮頸活檢/錐切及手術(shù)標(biāo)本共92例，其中宮頸癌52例，患者年齡32～85歲，中位年齡55歲;CIN40例，患者年齡30～64歲，中位年齡50歲。同期宮頸炎標(biāo)本26例用于對(duì)照，患者年齡35～78歲，中位年齡50歲。所有標(biāo)本均經(jīng)組織病理確診。患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療。宮頸癌患者臨床分期按2009版FIGO分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期14例，ⅡA期8例，ⅡB期6例，Ⅲ期13例，Ⅳ期11例。宮頸癌病理分級(jí):G1 10例，G2 10例，G3 32例。周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況:發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例。

1.2 檢測(cè)方法 采用免疫組化PV-9000法。所有抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。石蠟包埋，制成4 μm厚的切片。脫蠟、水化組織切片;高壓鍋抗原熱修復(fù);3%H2O2去離子水孵育以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;滴加一抗，4℃過(guò)夜;PBS沖洗，滴加聚合酶輔助劑，37℃孵育20 min;PBS沖洗后滴加辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG多聚體，37℃孵育30 min;應(yīng)用DAB溶液顯色;自來(lái)水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.3 結(jié)果判斷 于顯微鏡下觀察，每例觀察2張切片，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，取其平均值為細(xì)胞的陽(yáng)性率。結(jié)果判斷:p16陽(yáng)性定位在細(xì)胞核和(或)胞漿;p53和Ki67陽(yáng)性定位在細(xì)胞核。凡是呈現(xiàn)清晰的棕黃色顆粒為陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例＜10%為陰性(-)，比例≥10%為陽(yáng)性(+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，多個(gè)樣本間的比較采用卡方分割法(調(diào)整后P'＜0.016為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織、CIN與宮頸炎組織中 p16、p53和Ki67的表達(dá) p16、p53蛋白及Ki67在宮頸癌、CIN中、宮頸炎中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);兩兩比較顯示p16、p53蛋白及Ki67在宮頸癌、CIN組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于宮頸炎(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 宮頸癌組織、CIN組織和宮頸炎組織中p16、p53蛋白及Ki67的表達(dá) ［n(%)］

2.2 宮頸癌組織中p16、p53及Ki67蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 52例宮頸癌中，p16、p53蛋白及Ki67的陽(yáng)性表達(dá)與臨床分期和組織學(xué)分化程度有關(guān)(P＜0.05);與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和年齡無(wú)相關(guān)性(P＞ 0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 宮頸癌組織中p16、p53和Ki67蛋白表達(dá)之間的關(guān)系 52例宮頸癌中，p16和Ki67蛋白同為陽(yáng)性者21例，同為陰性者10例，p16與Ki67的表達(dá)相關(guān)(χ2=4.805，P=0.028);p53 和 Ki67 蛋白同為陽(yáng)性者19例，同為陰性者11例，p53與Ki67的表達(dá)相關(guān)(χ2=5.983，P=0.014)，見(jiàn)表 3。

表3 P16、P53和Ki67在宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性分析 (例)

3 討論

宮頸癌標(biāo)志物的檢測(cè)可反映腫瘤的生物學(xué)特性，對(duì)診斷、治療及預(yù)后具有重要意義。p16基因又稱MTS1(多腫瘤抑制基因)，為細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK)抑制蛋白，是1994年6月由Kamb報(bào)道的一種新型抑癌基因［3］。p16與細(xì)胞周期素D(Cyclin D)競(jìng)爭(zhēng)CDK4、CDK6，通過(guò)抑制它們的活性，使其一系列底物(如Rb)保持持續(xù)去磷酸化高活性，而不能解除pRb對(duì)轉(zhuǎn)錄因子E2F等的抑制，最終阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，直接抑制細(xì)胞增殖［4］。研究表明，在許多腫瘤中均有p16的突變 、缺失，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)紊亂，使細(xì)胞無(wú)限制增生，甚至癌變。孟慶更等［5］發(fā)現(xiàn)，p16陽(yáng)性表達(dá)與HPV感染密切相關(guān)，且可作為篩查宮頸癌及其癌前病變的重要指標(biāo)。Carozzi等［6］發(fā)現(xiàn)，p16檢查可預(yù)測(cè)HPV陽(yáng)性女性發(fā)生高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變或更差臨床狀況的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，p16蛋白在宮頸癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率為44.23%，CIN組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為35%，均明顯高于宮頸炎組織，結(jié)果與郭建華等［7］研究相符。且在本研究中，蛋白p16的陽(yáng)性表達(dá)與宮頸癌的臨床分期和組織學(xué)分化程度有關(guān)(P＜0.05)，蛋白p16在ⅡB期以上的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于Ⅰ期和ⅡA期(P＜0.05)。上述結(jié)果提示p16突變與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，提高檢測(cè)可用于高級(jí)別CIN和宮頸癌的早期診斷，與宮頸癌臨床分期及病理相結(jié)合，可用于判斷預(yù)后。

p53蛋白是重要的細(xì)胞生長(zhǎng)負(fù)調(diào)節(jié)因子，p53基因突變導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)功能喪失，使細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。它與細(xì)胞周期蛋白(cyclins)結(jié)合形成復(fù)合體，抑制依賴細(xì)胞周期蛋白的相關(guān)激酶(CDKs)活性，使細(xì)胞停滯在G1期或引起細(xì)胞程序性死亡，從而消除可能癌變的異常細(xì)胞［8］。p53基因大約有50%的突變率，當(dāng)p53基因發(fā)生突變時(shí)，可導(dǎo)致穩(wěn)定的蛋白質(zhì)不能完成抑制細(xì)胞增殖的作用，并且促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，使p53基因由抑癌基因轉(zhuǎn)為原癌基因［9］。由于野生型p53蛋白代謝不穩(wěn)定，半衰期僅20～30 min，且細(xì)胞內(nèi)含量低，因此，用免疫組化方法不能檢出;突變型p53蛋白半衰期延長(zhǎng)(數(shù)小時(shí))，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)突變型p53蛋白的集聚，因而用免疫組化方法能夠檢出［10］。本研究結(jié)果顯示，p53蛋白在宮頸癌和CIN組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于宮頸炎組織。同P16相似，蛋白p53的表達(dá)與宮頸癌的臨床分期和組織學(xué)分化程度有關(guān)(P＜0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及年齡無(wú)關(guān)(P＞0.05)，與樓朝霞等［11］研究相符。上述結(jié)果提示p53突變?cè)贑IN到宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其檢測(cè)可作為癌前病變和宮頸癌早期診斷及指導(dǎo)預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

Ki67抗原是Gerdes等于1983年發(fā)現(xiàn)的在增殖細(xì)胞中表達(dá)的一種核抗原，也是目前較為肯定的核增殖標(biāo)志。主要功能與細(xì)胞合成代謝有關(guān)。除了G0期和G1早期外，其他各期均有此抗原表達(dá)，惡性腫瘤中常呈高表達(dá)［12］。已有研究顯示，Ki-67抗原與肺癌、淋巴瘤、乳腺癌、頭頸部癌、消化道腫瘤等密切相關(guān)，可能與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、分級(jí)、分期、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后等各方面均有相關(guān)性［13］，可作為診斷、預(yù)測(cè)療效和預(yù)后等方面的標(biāo)志物。本研究中，Ki67抗原在宮頸癌和CIN組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于宮頸炎組織(P＜0.05)，提示在宮頸上皮細(xì)胞癌變過(guò)程中，細(xì)胞增殖活性逐漸增強(qiáng)。Ki67的陽(yáng)性表達(dá)在不同臨床分期和組織分化程度的宮頸癌標(biāo)本中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而在宮頸癌有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不同年齡，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示Ki67對(duì)鑒別宮頸癌及宮頸炎有重大的意義，且與宮頸癌的診斷及預(yù)后有一定的相關(guān)性。有研究提出，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Ki67高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，本結(jié)果似有不同，考慮與臨床檢查診斷有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移尚存在一定困難有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，宮頸癌中p16、p53及Ki67基因表達(dá)上調(diào)，與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，將三者作為生物標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，有利于對(duì)宮頸癌患者惡性程度及預(yù)后的評(píng)估。

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