丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥注射液對腎缺血-再灌注大鼠氧化應(yīng)激及腎功能的影響

劉小勇，陳勝龍

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，四川 成都 610500)

研究顯示氧化應(yīng)激在腎缺血再灌注(ischemiaresperfusion，IR)損傷過程中起重要作用［1～3］，因此，抗氧自由基的產(chǎn)生或及時清除氧自由基對改善IR造成的損傷極為重要。丹參是一味重要的活血化瘀藥，其主要有效成分丹參酮ⅡA(TanshineⅡA)對心、肝、腦、腎器官的缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用［4～6］。參麥注射液是在經(jīng)典方劑生脈飲的基礎(chǔ)上研制而來，具有益氣養(yǎng)陰、生津止渴以及固脫復(fù)脈的效果，實驗顯示其具有抗氧化應(yīng)激作用［7］。但丹參酮ⅡA聯(lián)用參麥注射液抗氧化效應(yīng)是否增強(qiáng)尚不清楚。本實驗以SD大鼠腎IR模型為基礎(chǔ)，以丹參酮ⅡA合用參麥注射液作為干預(yù)手段，測定腎臟組織中MDA和SOD含量，同時測定血肌酐和尿素氮水平，并與單用丹參酮ⅡA和參麥注射液進(jìn)行比較研究，觀察丹參酮ⅡA合用參麥注射液對IR腎的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠200只，體重200～250 g(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供)。參麥注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號:040803)。丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號:070823)。大鼠MDA、SOD等ELISA試劑盒為R＆D公司產(chǎn)品。

1.2 實驗動物分組及IR模型制備 SD大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組，IR模型組、丹參酮ⅡA組、參麥組及丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組各40只。所有動物均先給予標(biāo)準(zhǔn)飲食及自由飲水3d，然后給予藥物處理。丹參酮ⅡA組、參麥組及丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組分別給予丹參酮ⅡA 30 mg/kg、參麥注射液3 ml/kg、丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥注射液(丹參酮ⅡA 30 mg/kg、參麥注射液3 ml/kg)，均于術(shù)前連續(xù)灌胃給藥3 d，每天1次。假手術(shù)組和缺血再灌注組給予等量的生理鹽水灌胃。第4天進(jìn)行手術(shù)，術(shù)前12 h禁食不禁水，4%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，上腹部正中切口進(jìn)入腹腔，推開腸腔，暴露左側(cè)腎蒂，用無損傷微動脈夾夾閉腎動靜脈50 min后松開血管夾使血液復(fù)流進(jìn)行再灌注。觀察腎臟顏色變化情況(若復(fù)流不暢則終止實驗)，并于左腎開放血流前2 min時切除右腎，然后縫合關(guān)閉切口。假手術(shù)組按同樣步驟切除右腎，只是不鉗夾阻斷腎蒂血流。術(shù)后僅12 h、24 h組繼續(xù)原方案給藥。三組于術(shù)后3、6、12 h和24 h分別處死10只大鼠，常規(guī)分離血清，置于－80℃冰箱保存以備檢測。取腎臟組織2.5 g制成勻漿，離心后取上清液置于－80℃冰箱保存待測。

1.3 指標(biāo)測定 腎臟組織中MDA及SOD含量的測定嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行定量測定。血清中Cr和BUN水平應(yīng)用本院檢驗科的全自動生化分析儀測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織勻漿中MDA含量變化 在IR模型組中，腎組織勻漿MDA水平隨再灌注時間的延長逐漸升高，12 h達(dá)高峰后下降，在6 h和12 h與其它組相比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而丹參酮ⅡA組、參麥組、丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組和假手術(shù)組中MDA水平無此變化，且四組相互比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

2.2 腎臟組織勻漿中SOD活性變化 隨再灌注時間的延長，腎組織勻漿SOD活性顯著降低，于24 h達(dá)最低水平。丹參酮ⅡA組、參麥組在24 h、丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組在12 h和24 h與IR模型組相比不同程度地提高SOD的活力(P＜0.05)，與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組與丹參酮ⅡA組和參麥組相比在24 h SOD活力提高(P＜0.05);丹參酮ⅡA組與參麥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 各組大鼠不同時段腎臟組織中MDA和SOD活性水平

2.3 血Cr和BUN水平的變化 IR模型組、丹參酮ⅡA組、參麥組和丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組大鼠血Cr和BUN水平隨病程進(jìn)展逐漸升高，各時點與假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。丹參酮ⅡA組、參麥組和丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組與IR組比較，血Cr和BUN水平低于IR組(P＜0.05);丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組與丹參酮ⅡA組和參麥組比較，在24 h血Cr和BUN值均降低明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而丹參酮ⅡA組與參麥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

3 討論

腎缺血再灌注損傷(ischemia-resperfusion injury，IRI)是臨床常見的病理生理過程，是導(dǎo)致缺血性急性腎衰竭的主要原因之一，病死率很高，即便存活的患者亦有部分轉(zhuǎn)變?yōu)榻K末期腎臟疾病。因此，如何減輕或避免腎IRI已經(jīng)成為臨床醫(yī)師必須高度重視的問題。氧自由基增多導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷在缺血再灌注損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。缺血后急性腎衰竭時，氧自由基大量產(chǎn)生主要來源于黃嘌呤氧化酶途徑，腎缺血后ATP降解生成大量的次黃嘌呤，再灌注后由于恢復(fù)供氧，次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶催化下生成黃嘌呤，同時產(chǎn)生大量的氧自由基和羥自由基，這些氧自由基主要通過膜的脂質(zhì)過氧化對組織造成損害，即對生物膜中多價不飽和脂肪酸進(jìn)行降解，而損害細(xì)胞膜和線粒體膜的結(jié)構(gòu)和功能，造成各種細(xì)胞功能障礙。腎臟在缺血再灌注損傷時，由于其細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜由大量的多不飽和脂肪酸構(gòu)成，所以對氧自由基介導(dǎo)的損傷特別敏感。MDA是氧自由基與脂質(zhì)過氧化的分解產(chǎn)物，可與體內(nèi)多種物質(zhì)發(fā)生交聯(lián)而引起損害，因此，測定MDA不僅可以反映氧自由基的生成，還可間接反映細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度［8］。缺血-再灌注時MDA含量越高，體內(nèi)脂質(zhì)氧化程度越高，組織損傷越重。SOD是生物體內(nèi)防御氧化損傷的一種十分重要的金屬酶，對氧自由基有強(qiáng)烈清除作用［9］。

表2 各組大鼠不同時段血清Cr和BUN水平

實驗顯示，丹參主要有效成分丹參酮ⅡA對心、肝、腦、腎器官的缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用［4～6］;參麥注射液具有抗氧化應(yīng)激作用［7］。臨床研究顯示，聯(lián)用丹參酮ⅡA和參麥注射液對缺血性心臟病有明顯改善作用［10］。本實驗觀察到:IRI時，腎組織勻漿MDA含量隨再灌注時間的延長逐漸升高，于12 h達(dá)高峰，單用丹參酮ⅡA、參麥注射液或二者聯(lián)用均可拮抗IRI時MDA水平的增高，表明在IR中，丹參酮ⅡA、參麥注射液、丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥注射液對脂類過氧化均有阻止效應(yīng)，可以降低氧自由基水平。為確定IRI時，丹參酮ⅡA和參麥注射液的抗氧化作用是否參與了細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除酶活性的調(diào)節(jié)，我們檢測了氧自由基清除酶SOD活性。發(fā)現(xiàn)與IR模型組相比，丹參酮ⅡA組、參麥組在24 h、丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組在12 h和24 h提高SOD的活力，與假手術(shù)組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義;丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組與丹參酮ⅡA組和參麥組相比在24 h SOD活力提高，表明丹參酮ⅡA、參麥注射液、丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥注射液由于增高了氧自由基清除酶SOD活性，從而清除了IRI時增多的氧自由基，使氧自由基水平降低，其介導(dǎo)產(chǎn)生的MDA水平減少，且聯(lián)用丹參酮ⅡA和參麥注射液優(yōu)于單用效應(yīng)。丹參酮ⅡA組，參麥組，尤其是丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組腎功能受到影響的程度和IR模型組相比均明顯降低，說明丹參酮ⅡA、參麥注射液，尤其聯(lián)用丹參酮ⅡA和參麥注射液對腎臟IRI具有保護(hù)作用。

［1］Ebrahimi A，Salimi F，Safaei M，et al.How effective are alprostadil and hydrocortisone on reperfusion injury in kidney after distant organ ischemia［J］.J Res Med Sci，2013，18(9):755-758.

［2］Trujillo J，Chirino YI，Molina-Jijón E，et al.Renoprotective effect of the antioxidant curcumin:Recent findings［J］.Redox Biol，2013，1(1):448-456.

［3］Yamamoto S，Hagiwara S，Hidaka S，et al.The antioxidant EPC-K1 attenuates renal ischemia-reperfusion injury in a rat model［J］.Am J Nephrol，2011，33(6):485-490.

［4］Liang R，Bruns H，Kincius M，et al.Danshen protects liver grafts from ischemia/reperfusion injury in experimental liver transplantation in rats［J］.Transpl Int，2009，22(11):1100-1109.

［5］Chang PN，Mao JC，Huang SH，et al.Analysis of cardioprotective effects using purified Salvia miltiorrhiza extract on isolated rat hearts［J］.J Pharmacol Sci，2006，101(3):245-249.

［6］Tang C，Xue H，Bai C，et al.The effects of Tanshinone IIA on bloodbrain barrier and brain edema after transient middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Phytomedicine，2010，17(14):1145-1149.

［7］余喜訊，李莉華，馮志強(qiáng)，等.參麥注射液對兔缺血再灌流性腎損傷的預(yù)防作用研究［J］.瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000，23(5):348-350.

［8］Spirlandeli AL，Deminice R，Jordao AA.Plasma malondialdehyde as biomarker of lipid peroxidation:effects of acute exercise［J］.Int J Sports Med，2014，35(1):14-18.

［9］Schneeberger H，Schleibner S，Schilling M，et al.Prevention of acute renal failure after kidney transplantation by treatment with rh-SOD:interim analysis of a double-blind placebo-controlled trial［J］.Transplant Proc，1990，22(5):2224-2225.

［10］衛(wèi)蓉，丁應(yīng)勇，張書國.參麥注射液加丹參酮注射液對氣陰兩虛夾血瘀型冠心病心絞痛的療效觀察及對同型半胱氨酸的影響［J］.貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，33(6):40-42.