肝癌介入治療后血清缺氧誘導因子和血管內皮生長因子含量變化對預后的影響

管清龍， 紀衛政， 任偉新， 顧俊鵬

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，我國肝癌的死亡率位居各種惡性腫瘤的第2位。肝癌缺少首發癥狀，發現時患者多處于中晚期，常不能手術根治，5年生存率遠低于5%。近年來，隨著影像設備的不斷發展、微創技術水平的提高，在大型設備數字減影（DSA）機應用下，對不能手術切除的肝癌可采用肝動脈灌注化療栓塞術 （transarterial chemoembolization，TACE）治療，現已認為其是標準姑息性治療晚期肝癌的主要方法［1-3］。TACE治療的目的是減少、阻斷腫瘤血供，使腫瘤缺血、缺氧壞死。相關研究認為，缺氧誘導因子（HIF）-1a作為氧平衡調節的重要因子，影響腫瘤基因和細胞的合成和表達，對腫瘤復發、轉移等起重要作用，誘導血管內皮生長因子（VEGF）基因轉錄，使VEGF mRNA穩定性增加，VEGF及受體表達上調，通過癌細胞和內皮細胞之間相互影響、雙向旁分泌促進血管生成［4］。目前，對于TACE治療后，肝癌患者血清HIF-1a、VEGF含量變化對預后的預測尚少見報道。本文通過檢測60例TACE患者治療前、后血清中HIF-1a、VEGF的含量變化及分析相關因素的生存曲線，評估對預后的影響，為肝癌介入術后的預后評估提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2007年1月—2012年1月選擇60例肝癌患者行TACE治療，其中男性33例，女性27例；年齡27～78歲（中位年齡54歲）。Child-Pugh分級A級21例，B級35例，C級4例。巴塞羅那臨床分期診斷標準（Barcelona clinic liver cancer，BCLC）分級：0級11例，A級22例，B級27例。甲胎蛋白（AFP）＞400 μg/L 45例，≤ 400 μg/L 15例。 腫瘤長徑 ＞ 5 cm 34例，≤5 cm 26例；單發31例，多發29例。有門脈癌栓12例。KPS評分：100分52例，90～99分8例。血管侵犯17例。乙型肝炎病毒（HBV）陽性38例，丙型肝炎病毒（HCV）陽性14例，其他8例。選擇20例正常人作為對照組，檢測治療前、后血清中 VEGF、HIF-1a含量。

1.1.1 納入標準 ①經CT、超聲或兩種以上影像學診斷確診；② 病理確診；③ 符合BCLC標準；④凝血功能正常。

1.1.2 排除標準 ①KPS評分 ＜90分；② 腹水（中～大量）；③ 凝血異常；④ 轉氨酶升高大于正常值3倍以上。

1.2 治療方案

患者取仰臥位，常規消毒鋪巾后，右側腹股溝處股動脈處局部麻醉，置入導管后，“冒煙”示在動脈內，將導管置于腹腔干內造影示肝內多發異常腫瘤染色，超選擇腫瘤供血動脈給予藥物灌注化療，根據腫瘤大小再給予碘油等混合乳劑栓塞治療。治療完畢后，肝內碘油沉積良好，異常腫瘤染色基本消失。

1.3 血清HIF-1a、VEGF含量檢測

在術前、術后1 d、1周、1個月時，采集清晨空腹外周靜脈血液4 ml，置無菌管中，靜置30～60 min，3 000 g離心15 min，離心后取血清置于-80℃冰箱待測。采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血清HIF-1a、VEGF含量，按說明書操作，全自動酶標儀450 nm波長處測吸光度（A）值，進行雙孔檢測，獲得標本血清中HIF-1a、VEGF的含量。

1.4 計算血清HIF-1a、VEGF中位值

測出術前、術后血清HIF-1a、VEGF含量，計算術后1 d和1周的血清HIF-1a、VEGF中位值，根據中位值劃分血清HIF-1a、VEGF含量的高低，評價其含量對預后的影響。

1.5 多因素分析

根據影像學、實驗室檢查及隨訪情況，對相關臨床數據進行分類及統計，對常見影響肝癌預后的因素進行分析，如KPS評分、Child-Pugh分級、門脈癌栓、血管侵犯、肝內外轉移等因素對生存時間的影響。

1.6 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件對數據進行分析。用Log-Rank等級檢驗進行比較，以均數±標準差s）表示。用Cox回歸模型分析對KPS評分、Child-Pugh分級、門脈癌栓、血管侵犯、肝內外轉移等因素對生存時間的影響。用Kanplan-Meier分析TACE術后血清HIF-1a、VEGF含量對預后的生存曲線。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

60例患者中，因不能行手術切除而首次行TACE治療33例，27例為術后再次復發，基本行2～3次TACE術，平均治療間隔時間為1～6個月。47例在TACE治療1個月后病灶內碘油沉積良好，病灶內未見腫瘤血供；所有患者基本情況滿足：KPS評分≥90分。

2.1 治療前、后血清HIF-1a、VEGF含量變化

60例患者治療前、后血清HIF-1a、VEGF含量呈現不同的變化。TACE組患者術前HIF-1a、VEGF含量明顯高于對照組，差異有統計學意義 （P＜0.001）。與術前相比，TACE組患者術后第1天血清內HIF-1a含量明顯升高（P＜0.001），而血清VEGF含量與術前相比差異無統計學意義 （P＞0.05）；術后1周和1個月時血清內HIF-1a、VEGF含量明顯下降（P ＜ 0.05，表 1）。

表2 肝癌患者術前、術后血清HIF-1a、VEGF含量

2.2 術后血清HIF-1a、VEGF含量與臨床特點關系

肝癌患者TACE術后不同時間血清HIF-1a、VEGF含量指標與門脈癌栓、Chid-Pugh分級、KPS評分、BCLC分期及血管侵犯等相關 （P＜0.05）；而與年齡、AFP含量、肝炎及腫瘤大小等無相關性（P＞0.05，表 2）。

表2 術后血清HIF-1a、VEGF含量與臨床特點的關系

2.3 相關因素對生存時間的影響

經Log-rank檢驗，本組患者中位生存時間為36個月，5年累積生存率為43.3%。Cox回歸分析回歸系數對風險度的變化，發現肝癌合并門脈癌栓及血管侵犯者的生存時間短于無門脈癌栓及血管侵犯者，同時不同的分級、分期及評分標準對生存時間有較大影響，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

2.4 血清內HIF-1a、VEGF變化對生存時間的影響

肝癌患者在TACE治療后，血清內HIF-1a、VEGF含量與肝癌伴有門脈癌栓、Child-Pugh分級、KPS評分、BCLC分期及血管侵犯等因素有明顯相關性。按術后1d、1周血清HIF-1a、VEGF含量中位值 （HIF-1a=588.2 pg/ml，VEGF=296.3 pg/ml）為界劃分高值或低值，經Kanplan-Meier分析預后的生存曲線，發現血清內HIF-1a、VEGF的含量高于中位值，其5年生存率較差，表明術后血清HIF-1a、VEGF含量的高低對預后有明顯影響 （P＜0.05，圖

表3 Cox回歸分析多因素對生存時間的影響

圖1 術后血清HIF-1a含量高低對生存時間的影響

圖2 術后血清VEGF含量高低對生存時間的影響

3 討論

肝癌血供的75%～80%來自于肝動脈，TACE阻斷供血動脈后，導致腫瘤組織缺氧。在缺氧狀態下，HIF-1a是調節細胞內氧代謝的關鍵因子之一，通過誘導多種血管生長因子表達刺激新生血管發生，促進腫瘤生長，其中以 VEGF 最為明顯［5-6］。Ryan等［7］發現在惡性腫瘤中HIF-1a水平高，可能是因為組織氧濃度降低，導致HIF-1a的表達增高。同時有文獻報道，血清HIF-1a、VEGF含量變化主要是術后癌細胞缺氧、壞死［8-10］，促使 HIF-1a 釋放，誘導VEGF表達，促進癌組織生長、浸潤、轉移，因此，在缺氧狀態下VEGF誘導新生血管的形成，可作為對腫瘤經TACE治療后預測預后的一項重要指標。國內有文獻報道，TACE術后肝細胞從缺氧到腫瘤新生血管生成過程中血清HIF-1a、VEGF含量會發生較大變化［11］，由于 VEGF誘導血管的生長晚于HIF-1a的變化，根據本文所得患者的基本數據發現，與術前相比，術后1 d的HIF-1a含量達到高峰（P ＜ 0.001），而血清 VEGF含量無差異（P ＞ 0.05）；術后1周VEGF含量較術前明顯下降 （P＜0.05）。TACE治療后血清HIF-1a、VEGF含量變化主要因為栓塞后病灶組織缺血、缺氧，術后急性誘導HIF-1a的快速表達與釋放，隨著腫瘤組織缺血、缺氧，腫瘤細胞壞死及腫瘤對氧耐受性增加，術后1周血清VEGF含量較術后1 d變化較大，表明腫瘤新生血管生成。因此，測量血清HIF-1a、VEGF含量變化可作為介入術后評估療效的良好指標。

肝癌生長依賴新生血管生成，病灶 ＞0.5 mm時誘導血管內皮細胞增殖。有研究證實VEGF有自分泌功能，能刺激癌細胞擴增，促使腫瘤新生血管生長加快，同時觀察到癌組織VEGF呈高表達狀態，與腫瘤進展及轉移明顯相關［12-13］。文獻報道在許多動物及人類腫瘤細胞中VEGF均呈高表達，且VEGF的表達還可作為預后的一項預測指標。本研究對肝癌的Child-Pugh分級、KPS評分、BCLC分期及伴有門脈癌栓、血管侵犯等因素進行分析，發現不同的分級、評分及分期HIF-1a、VEGF含量在TACE術后有不同變化（P＜0.05）；同時伴有門脈癌栓、血管侵犯者血清HIF-1a、VEGF含量明顯高于無伴有門脈癌栓及血管侵犯者（P＜0.05）；而與年齡、AFP含量、肝炎及腫瘤大小等對預后的影響差異無統計學意義（P＞0.05）。多因素分析發現血清HIF-1a、VEGF含量變化對預后起重要作用。本研究證實腫瘤供血動脈栓塞后，組織缺氧，誘導HIF-1a產生，經過細胞一系列的反應，促使VEGF表達增強。本研究通過COX回歸模型觀察TACE術后回歸系數對風險度的影響，發現主要相關因素在5年累計生存時間呈不同變化，肝癌合并門脈癌栓及血管侵犯者的生存時間較無門脈癌栓及血管侵犯者差，同時不同的分級、分期及評分標準對生存時間有較大影響，差異有統計學意義（P<0.05）。

有文獻報道，對TACE治療患者術前血清VEGF含量進行分析，得出中位值（VEGF=285 μg/L），根據中位值分陰性、陽性，根據分組情況證實血清VEGF含量高于中位值，其預后較差［14］。在TACE治療后，是否可以在缺氧狀態下使HIF-1a表達下調，增加組織對缺氧的耐受性，使VEGF表達減少，減少腫瘤新生血管形成，是否可以根據HIF-1a表達高低提出參考值，對預后進行預測仍有待進一步研究。本文嘗試性提出TACE術后中位值概念，期望能在TACE術后按血清HIF-1a、VEGF含量變化對預后進行有效預測。本文不足之處是病例數較少，尚需擴大樣本進行臨床分析及研究。

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