CT灌注成像評價抗血管生成藥物不同給藥方式的療效

劉 麗， 陳 波， 吳垠垠， 袁 磊， 曹建民， 盧光明， 許 健

腫瘤血管生成是腫瘤生長的“血管性開關”。因此，抗血管生成治療是腫瘤研究的又一重要領域。O’Reilly等［1］的實驗證明重組人血管內皮細胞抑制劑在抗血管生成治療中顯示出明顯的劑量依賴性。基于此，探索新的更有效的腫瘤抗血管治療方案具有臨床實際意義。本實驗通過CT灌注成像評價抗血管生成藥物重組人血管內皮抑制素注射液不同給藥方式治療兔后腿VX2移植瘤的效果，探索不同給藥途徑進行抗血管治療在腫瘤治療中的療效差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

雄性新西蘭大白兔21只，6～8周齡，重2～2.5 kg，購于南京軍區南京總醫院比較醫學科，符合醫學實驗動物標準，無特異病原體級飼養。實驗細胞株為抗兔型VX2細胞株，（由東南大學中大醫院介入科實驗中心惠贈）。重組人血管內皮抑制素注射液購自山東先聲麥得津生物制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建模方法及實驗分組 分別取 5 ml VX2細胞株種植于3只兔左后腿肌肉間。飼養14 d，經磁共振掃描監測腫瘤長到2 cm大小，則培育傳代荷瘤兔成功，取出腫瘤組織制備成瘤組織懸濁液。另選取健康成年新西蘭大白兔18只，分別在左后腿肌肉間注射腫瘤組織混懸液5 ml。飼養10 d，待其長至1.5 cm為建模成功。將模型動物按數字法隨機分為靜脈組、局部組和對照組，每組6只。其中靜脈組連續7 d于耳緣靜脈按說明書給予重組人血管內皮細胞抑制素注射液；局部組經皮穿刺于腫瘤局部行瘤內注藥術，將相當于7 d靜脈給藥劑量的注射液1次性注入瘤內，若瘤體過大則選擇多點注射；對照組在瘤內注射相當劑量的生理鹽水。治療前后行CT灌注檢查。治療7 d后將實驗動物處以安樂死、取瘤組織行病理檢查。

1.2.2 CT灌注成像檢測及圖像處理分析 CT灌注成像技術通過靜脈團注對比劑碘帕醇注射液（300 mg/L）后對選定層面行同層動態掃描，獲得該層面內每一像素的時間密度曲線 （time-density curve，TDC），根據該曲線的數學模型計算出血流量（BF）、血容量（BV）和表面滲透性（PS）等參數值。 首先行常規CT平掃，掃描參數：120 kV，160 mA，矩陣512×512，掃描周期0.5 s/周，重建層厚2 mm。掃描范圍從中下腹部至小腿，觀察種植腫瘤的部位，然后進行CT灌注掃描。以腫瘤最大層面為中心監測層面，灌注掃描范圍為4 cm。使用高壓注射器以3 ml/s的速率注入對比劑8 ml，延遲3 s后開始灌注掃描，總灌注時間40 s。掃描參數：120 kV，100 mA，矩陣512×512，掃描周期0.5 s/周，重建層厚2 mm。

所有圖片均傳入西門子Syngo工作站進行后處理，應用Body PCT軟件進行灌注后處理，以統一方式畫取感興趣區（region of interest，ROI），計算 BF、BV、PS血流動力學參數。所有數據的測量取8個ROI區，最后取平均值。同時在CT增強圖像上測量每個腫瘤的長徑與短徑 （mm），計算相對瘤體積 =a2b × 0.52（mm3）（a為短徑，b 為長徑），參照文獻［2］計算抑瘤率。抑瘤率=（對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積）/對照組瘤體積 ×100%。

1.2.3 病理組織學檢查 分別進行常規蘇木精-伊紅染色（HE）及腫瘤標本的微血管密度（MVD）免疫組化檢測。MVD計數參照文獻［3］報道的方法，記錄3個視野內的微血管數，取平均數作為該腫瘤組織的MVD值。

1.3 統計學分析

采用SPSS16.0軟件進行統計學分析。定量資料以均數±標準差表示。數據均為定量資料采用Kolmogorov-Smirnov Test進行正態性檢驗。各組間數據符合正態性以均數±標準差表示，組內比較采用2 Independent Samples Test方法，各組間多重比較采用單向方差分析（One-Way ANOVA）。分析兩正態定量資料間的相關性采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤生長

實驗建模成功率100%。治療7 d后靜脈組腫瘤平均體積（617.56 ± 45.78）mm3、局部組（546.37 ±65.35）mm3、對照組 （1247 ± 67.58） mm3，靜脈組及局部組均較空白對照組小（P＜0.05），而靜脈組與局部組間差異無統計學意義（P＞0.05）。靜脈組及局部組抑瘤率分別為50.52%和56.21%（P＞0.05）。此外，局部組中有1只動物腫瘤出現明顯完全壞死（圖 1）。

2.2 CT灌注定量分析

圖1 局部組治療前（1a～1d）、后（1e～1h）CT灌注圖

治療前后三組CT灌注結果見圖1～3，各組CT灌注參數均符合正態分布，與病理測量結果的比較見表1。組內比較結果顯示，靜脈組及局部組治療后 BF、BV、PS較治療前減少（P＜ 0.05）。 而對照組治療前后灌注參數差異無統計學意義 （P＞0.05）。治療后組間比較顯示，靜脈組與局部組BF、BV、PS差異無統計學意義（P＞0.05），均少于對照組（P ＜ 0.05）。

2.3 病理及免疫組化檢查

HE染色檢查示各組瘤組織均有壞死區，但靜脈組及局部組切片中可見大片壞死結構，中心區散在分布殘留腫瘤細胞碎裂的核結構，周圍實質性成分較少。對照組HE染色見少量壞死區（圖4）。免疫組化染色結果見表1、圖4。Pearson相關性分析得出BF、BV、PS與 MVD 值均有相關性（表 1）。

3 討論

血管抑制性治療是一種以阻止和 （或）減少病變組織內血管生成為策略的治療方法。許多抗血管生成藥物，如重組人血管內皮抑制素注射液、貝伐珠單抗、伊馬替尼等已經在臨床或臨床前實驗階段取得了不同程度的效果［4］。CT灌注成像在腫瘤血管生成及抗腫瘤治療療效評價方面顯示出良好的應用前景［5-8］。我們采用重組人血管內皮抑制素注射液，用CT灌注檢查方法結合病理檢查評價不同途徑的腫瘤抗血管生成治療療效，探索新的腫瘤抗血管治療途徑。

表1 三組VX2腫瘤治療前后CT灌注參數及病理指標比較

表1 三組VX2腫瘤治療前后CT灌注參數及病理指標比較

與對照組比較，aP＜0.05

組別 n 血流量（ml·100 ml-1·min-1） 血容量（ml/100 ml） 表面滲透性（ml·100 ml-1·min-1） 微血管密度治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后靜脈組 6 119.10±9.33 76.77±21.43a 104.65±4.51 79.65±25.51a 41.63±7.28 23.69±13.43a 9.01±1.17a局部組 6 125.55±14.70 60.95±21.47a 99.82±5.83 75.53±26.77a 42.03±14.32 24.33±7.16a 9.73±1.01a對照組 6 142.84±29.73 136.17±27.95 110.06±10.08 133.7±20.36 50.17±19.65 48.17±10.99 17.31±1.24相關性 rBF=0.746 rBV=0.863 rPS=0.785

圖2 靜脈組治療前（2a～2d）、后（2e～2h）CT灌注圖

圖3 對照組治療前（3a～3d）、后（3e～3h）CT灌注圖

圖4 三組微血管密度（4a～4c免疫組化染色，4d～4f HE，×200）

本研究中，各組治療后腫瘤體積的變化說明單純抗血管治療并不能完全抑制腫瘤進展，但能在一定程度上控制腫瘤進展。本文結果表明，各CT灌注參數與MVD均具相關性，因此，可以結合CT灌注與病理檢查評價腫瘤微血管狀態。對于治療前后各組CT灌注檢查結果的組內比較及治療組與對照組的比較分析可見，重組人血管內皮抑制素在抗血管治療過程中，可降低腫瘤MVD，降低腫瘤灌注量；改善腫瘤血管微環境，修剪不成熟的血管和強化殘留的血管，提高殘留血管的完整性和功能，使血管網的結構趨于正常，降低腫瘤血管滲透性。而對照組中多種血管生成因子促進不成熟血管生成，腫瘤細胞生長較為旺盛，需更多血液供應，刺激MVD增加，而這種異常增生的血管“滲透性”明顯增高。

另外，靜脈組與局部組間療效無差異的原因可能是影響血管生成的因素多且復雜，腫瘤內部非均一性及血流灌注在空間和時間分布上不均衡所致。也可能由于局部給藥次數的原因，局部給藥經皮穿刺一次性注入相當于7 d靜脈給藥劑量總和的重組人血管內皮抑制素注射液，短時間瘤內高濃度藥物可能使腫瘤短期急劇血管生成抑制，導致腫瘤中心出現徹底壞死區，但是由于重組血管內皮抑制素半衰期短暫，造成局部高濃度藥物持續時間較短，可能出現短暫抑制后的各種促血管生成因子增加，導致殘存周圍腫瘤實質內血管生長，致使灌注量增加。此外，動物模型間存在較大的個體差異、樣本數量較少也可能是形成誤差的另一原因。但是，在局部組中1只動物腫瘤出現徹底壞死，而這種現象在靜脈組及對照組中均未見到，進一步肯定了局部高濃度的內皮抑制素能產生強烈的抑制腫瘤血管內皮細胞的生長、抑制腫瘤血供的效應。但是，此動物腫瘤體積較其他稍小，可能因為抗血管生成治療針對腫瘤早期及新生血管更有效，而對于進展期腫瘤及成熟血管效果較差。因此，不同的給藥途徑對腫瘤血管生成具有不同的影響效果，但其具體機制還有待進一步研究。

本研究的局部用藥仍然存在以下問題：①局部藥物濃度的確定，其安全濃度和最佳抑制效應濃度的確定。②局部應用內皮抑制素對腫瘤轉移的抑制作用療效的評定，包括其作用持續時間、藥物在腫瘤區和非腫瘤區的分布等。

總之，CT灌注成像能無創、準確、動態地監測腫瘤抗血管治療的療效。局部瘤內注藥術為腫瘤抗血管治療提供了一種新的臨床治療途徑。

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