新型抗癲癇藥瑞替加濱的遺傳毒性雜質(zhì)的控制

天津市漢康醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司(300203)刁榮蓉 劉立明 張曼 孫影倩 侯俊

關(guān)鍵字：瑞替加濱；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；遺傳毒性雜質(zhì)

瑞替加濱是一種口服起效的鉀離子通道開(kāi)放劑，由葛蘭素史克和Valeant制藥公司共同研發(fā)生產(chǎn)。于2011年3月經(jīng)EMEA批準(zhǔn)在歐洲上市，商品名：Trobalt?；于2011年6月經(jīng)FDA批準(zhǔn)在美國(guó)上市，商品名為Potiga?。適用于18歲及以上成人癲癇部分性發(fā)作的輔助治療。

本品是一種具有新作用機(jī)制的抗癲癇藥。研究證實(shí)，瑞替加濱的作用與電壓門控型鉀離子通道（KCNQs）有關(guān)，其中作用于KCNQ2/3通道調(diào)節(jié)M型鉀電流（[Ik（M）]）是其主要的作用機(jī)制[1][2][3]。瑞替加濱的抗癇機(jī)制決定了其作用特點(diǎn)有別于其他抗癲癇藥物，這不是作用于神經(jīng)元的N -甲基- D-天冬氨酸（NMDA），亦不能阻斷神經(jīng)元鈉離子電流的內(nèi)向鉀電流和混合性鈣離子電流，而是通過(guò)激活γ-氨基丁酸（GABA）[4]誘導(dǎo)的電流而起作用。

根據(jù)EMEA公布的遺傳毒性雜質(zhì)的警示結(jié)構(gòu)，瑞替加濱具有苯胺基結(jié)構(gòu)，原研廠家對(duì)本品進(jìn)行了小鼠骨髓的微核實(shí)驗(yàn)以及大鼠肝細(xì)胞的體內(nèi)/體外UDS實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示為陰性，在非臨床研究的Ames試驗(yàn)中，研究顯示當(dāng)雜質(zhì)含量降低到限度閾值以下時(shí)，Ames試驗(yàn)則顯示為陰性，因此瑞替加濱無(wú)遺傳毒性，但通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，本品在合成過(guò)程中也涉及苯胺基結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)，為了將其控制在限度閾值以下，我們進(jìn)行了研究。

附圖1 乙基（4-{[4-氟苯基）甲基]氨基}-2-硝基苯基)氨基

附圖2 乙基（4-{[(1E)-(4-氟苯基)亞甲基]氨基}-2-硝基苯基）氨基

1 根據(jù)合成工藝分析，本品中可能含有如下遺傳毒性雜質(zhì)

1.1 雜質(zhì)1 乙基（4-{[4-氟苯基）甲基]氨基}-2-硝基苯基)氨基，見(jiàn)附圖1。

1.2 雜質(zhì)2 乙基（4-{[(1E)-(4-氟苯基)亞甲基]氨基}-2-硝基苯基）氨基，見(jiàn)附圖2。

附圖3 雜質(zhì)線性試驗(yàn)

1.3 上述雜質(zhì)由于其含有苯胺基結(jié)構(gòu)而可能具有遺傳毒性，因此按照EMEA《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》要求，瑞替加濱最大日劑量為1.2g/天，毒理學(xué)擔(dān)憂閾值(TTC)為1.5μg/天，故本品遺傳毒性雜質(zhì)的雜質(zhì)限度應(yīng)為(1.5μg/天)/(1.2g/天)=1.25ppm，因此我公司制定了遺傳毒性雜質(zhì)的檢測(cè)方法，已將其控制在該限度一下。

2 測(cè)定方法

2.1 儀器 安捷倫G6410A 三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀。

2.2 質(zhì)譜條件

①檢測(cè)方式：正離子檢測(cè)方式；②離子源：電噴霧離子化源；③離子源噴射電壓：4.0kV；④毛細(xì)管溫度 (℃)：325；⑤輔助氣流速： 45；⑥掃描方式：一級(jí)全掃描方式，二級(jí)全掃描方式；⑦色譜柱：Waters RP18 5μm， 4.6 x 150mm Column。

附表1 線性試驗(yàn)結(jié)果

附表2 雜質(zhì)2回收率試驗(yàn)結(jié)果

附表3 雜質(zhì)2回收率試驗(yàn)結(jié)果

附表4 液相梯度

2.3 液相梯度 見(jiàn)附表4。

3 試驗(yàn)

3.1 定位試驗(yàn) 精密稱取瑞替加濱與雜質(zhì)1、2適量，配制雜質(zhì)混合溶液，注入液相色譜儀，進(jìn)行LC-MS/MS試驗(yàn)[5]，由混合溶液圖譜可知，各通道均可良好檢出，瑞替加濱主峰保留時(shí)間為6.3min，兩雜質(zhì)1、2的保留時(shí)間分別為7.4min和8.3min，主成分與雜質(zhì)峰分離良好。

3.2 線性試驗(yàn) 精密稱取雜質(zhì)1、2各10mg，置同一100ml量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備溶液，精密量取儲(chǔ)備溶液，加乙腈稀釋制成每1ml中約含上述雜質(zhì)2ng、4ng、6ng、8ng、10ng的溶液，作為溶液①、②、③、④、⑤，分別精密量取上述溶液各5μl注入液相色譜儀，進(jìn)行LC-MS/MS試驗(yàn)，記錄色譜圖，見(jiàn)附圖3，附表1。由以上試驗(yàn)可知，上述雜質(zhì)在濃度在0～10ng/ml中線性關(guān)系良好。

3.3 檢測(cè)限試驗(yàn) 取定量限溶液3ml，置10ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，精密量取5μl注入液相色譜儀，進(jìn)行LCMS/MS試驗(yàn)，記錄色譜圖。各雜質(zhì)檢測(cè)限濃度均為0.6ng/ml。相當(dāng)于0.2ppm的雜質(zhì)可檢出。

3.4 回收試驗(yàn) 精密量取儲(chǔ)備溶液適量，加乙腈溶解并稀釋制成每1ml中約含雜質(zhì)1、2 各32、40、48ng的溶液，作為儲(chǔ)備溶液，平均制備三份，精密量取1ml，置10ml量瓶，分別加入瑞替加濱32mg，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，分別精密量取5μl，注入液相色譜儀，進(jìn)行LC-MS/MS試驗(yàn)，以測(cè)得量/添加量×100%計(jì)算回收率，結(jié)果各雜質(zhì)回收率良好。見(jiàn)附表2，3。

4 結(jié)論

該方法測(cè)定瑞替加濱的遺傳毒性雜質(zhì)可行，且經(jīng)檢測(cè)本品中雜質(zhì)1、2均未檢出，說(shuō)明我公司合成的原料藥遺傳毒性雜質(zhì)符合限度要求。