RP-HPLC法測定藥材黑豆中大豆苷的含量

上海海天醫藥科技開發有限公司（200023）陸泉

黑豆為豆科植物大豆Glycine max ( L. )Merr.的干燥成熟種子，全國各地均有栽培，主產于山西、河北、陜西[1]，享有“豆中之王”的美譽。黑豆其性甘味平，色澤較黑，歸脾、腎經。主要具有益精明目，養血祛風，利水解毒的作用[2]。黑豆含有多種化學活性成分，主要為黃酮類、多糖、色素、皂苷等[3]。2010年版中國藥典中黑豆以大豆苷為對照品進行藥材鑒別。大豆苷為黃酮類成分，具有抗癌、抗氧化、調節免疫、防輻射、預防骨質疏松等多種藥理作用[4]。黑豆藥材中大豆苷的含量測定文獻報道較少[5]。本文采用RPHPLC法測定了不同產地黑豆中大豆苷的含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AD高效液相色譜儀（日本SHIMADZU），SPD-M20A紫外檢測器（日本SHIMADZU）。BT125D十萬分之一分析天平（德國Sartorius），sk250h型超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司），FZ-102型臺式藥材粉碎機（上海淀久中藥機械制造有限公司）。

1.2 材料 大豆苷標準品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：111738-200501），甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA），娃哈哈飲用純凈水，其余試劑（分析純，市售）。黑豆藥材3批，均為市售品，經安徽農業大學植物學教研室何金鈴教授鑒定為豆科植物Glycine max (L.)Merr.的干燥成熟種子。

2 方法與結果

附圖 大豆苷標準品（A）與樣品（B）的HPLC圖

附表1 加樣回收率試驗結果（n = 9）

附表2 黑豆藥材中大豆苷的含量測定結果（n = 3）

2.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱：cosmosil-C18柱（250mm×4.6mm，5 μm），流動相：乙腈-0.1 %三氟乙酸溶液（12∶88， v/v）；柱溫：25℃；流速：1mL/min；檢測波長：254nm；進樣量10 μL。大豆苷在此色譜條件下的保留時間為9.84 min，分離度＞1.5，按大豆苷計算理論塔板數＞4000，色譜峰對稱因子在0.95～1.05之間。色譜圖見附圖。

2.2 標準品溶液制備 取干燥至恒重的大豆苷標準品約5.55 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得111.0 μg/mL的大豆苷標準品儲備液。

2.3 供試品溶液制備 黑豆干燥藥材（產地1）粉碎過篩，取藥材粉末約1.5 g，精密稱定，置100 mL平底燒瓶中，加入甲醇50 mL，超聲提取3次，每次30 min。合并提取液，旋蒸至干，殘渣定量轉移至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾即得供試品溶液。

2.4 線性關系的考察 精密吸取大豆苷標準品儲備液 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL 置 10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得大豆苷系列標準溶液，在上述色譜條件下，分別進樣分析，進樣量10 μL，記錄峰面積。以標準品峰面積（Y）為縱坐標，標準品濃度（X，μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線。得大豆苷回歸方程：Y=4959227.96X-16409.98 ( R=0.9999 )。結果表明，大豆苷在1.11～88.8 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗 取大豆苷標準品溶液（5.55 μg/mL），在上述色譜條件下，連續進樣6次，進樣量10 μL，測定峰面積，標準曲線法計算含量。大豆苷標準品溶液的RSD為0.35 %。結果表明，儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取黑豆干燥藥材粉末（產地1），按“供試品溶液制備”項下操作平行制備供試品溶液6份，在上述色譜條件下，進樣量10 μL，測定峰面積，標準曲線法計算含量。供試品溶液（產地1）大豆苷的RSD為1.14 %，結果表明，該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取大豆苷供試品溶液，避光放置，在上述色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、10、24 h進樣分析，進樣量10 μL，測定峰面積，標準曲線法計算含量。大豆苷供試品溶液的RSD為0.64%，結果表明，大豆苷在24 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗 取黑豆干燥藥材粉末（產地1）約0.45 g（大豆苷的含量為288.9 μg/g），共9份，精密稱定，分別加入相當于原藥材大豆苷含量50%、100%、150%的大豆苷標準品溶液，每濃度3份。按“供試品溶液制備”項下操作，并在上述色譜條件下進樣分析，進樣量10 μL，測定峰面積，標準曲線法計算含量。根據加樣回收率公式，計算加樣回收率，結果見附表1。大豆苷平均回收率為99.99 %，RSD為1.45 % ( n = 9 )，結果表明，該方法準確度良好。

2.9 樣品含量測定 取各產地黑豆干燥藥材粉末，按“供試品溶液制備”項下操作，并在上述色譜條件下進樣分析，進樣量10 μL，測定峰面積，標準曲線法計算大豆苷含量，結果見附表2。

3 討論

黑豆是黑色食品中的重要一員，有著獨特的營養和藥用價值，在藥品和食品行列中均占有非常重要的位置。我國黑豆資源較為豐富，隨著人們對黑豆營養和藥用價值的逐漸認識和對黑豆的成分與藥理作用關系的深入研究，黑豆的開發利用前景將會更加廣闊。

黑豆為《中國藥典》2010年版新加入品種，但藥典中尚無含量測定項。本文建立了黑豆藥材中大豆苷含量測定的RPHPLC法，方法簡單可行，重復性好，結果準確可靠，為完善黑豆藥材質量標準提供參考。