核酸定量檢測試驗應用于HIV-1感染實驗室診斷的探討

李繁，蔣巖，張桂云，蒲鑫，潘品良

中國疾病預防控制中心 性病艾滋病預防控制中心，北京 102206

自1997年《全國艾滋病檢測工作規(guī)范》實施以來，人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency vi?rus，HIV）抗體檢測作為HIV實驗室診斷主要檢測手段的檢測策略已在我國實行了十幾年的時間。《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》2009年版規(guī)定，HIV抗體檢測分為篩查試驗（最常用的為酶聯(lián)免疫吸附試驗，ELI?SA）和確證試驗（蛋白印跡法，Western印跡）[1]。

HIV抗體檢測只適用于HIV感染窗口期后艾滋病患者整個病程中的艾滋病實驗室診斷，不適用于HIV感染窗口期和HIV陽性母親所生18個月以下嬰兒（由于母體抗體的干擾）。此外，受被檢測者自身免疫狀況、病程及感染其他疾病的影響，以及高敏感性的檢測方法和試劑等原因，抗體確證試驗經(jīng)常會出現(xiàn)“抗體不確定”樣本[2]。此類樣本須結(jié)合流行病學資料進行3個月后的跟蹤隨訪，這給受檢者帶來巨大的精神壓力，也不利于HIV的提早治療和預防。

HIV-1核酸定量（HIV-1病毒載量）檢測方法直接檢測血液中HIV的RNA量，可早于Western印跡檢測出血漿中的病毒，已經(jīng)越來越受到人們的關(guān)注。在此，我們擬綜合對比分析HIV-1核酸定量試驗和Western印跡檢測結(jié)果，探討HIV-1核酸定量檢測用于HIV-1感染實驗室診斷的可行性，分析此方法在實際應用中的優(yōu)點和局限性。

1 材料和方法

1.1 標本來源

選取參比室?guī)齑娴?45例第四代篩查試劑檢測結(jié)果為陽性的血漿樣本。

1.2 檢測方法

1.2.1 確證試驗（Western印跡，以下簡稱WB）采用MP生物醫(yī)學公司HIV1+2型抗體檢測試劑盒（免疫印跡法，HIV BLOT2.2），儀器為Autoblot system 20免疫印跡儀。

1.2.2 HIV-1核酸定量檢測試驗（病毒載量試驗）采用Roche公司COBAS AmpliPrep/COBAS Taq?Man HIV-1 Test V2.0試劑盒，儀器為Roche公司Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan全自動分析系統(tǒng)。

以上試驗操作均嚴格按照試劑盒和儀器說明書進行，所有檢測試劑均在有效期內(nèi)。

1.3 WB判定標準

嚴格按照試劑盒說明書判定。HIV-1抗體陽性要求至少檢出2條env帶（gp41和gp160/gp120）及gag帶（p55、p24、p17）或 pol帶（p66、p51、p31）；HIV抗體陰性是指無HIV抗體特異帶出現(xiàn)；HIV抗體不確定性是指出現(xiàn)HIV抗體特異帶，但不足以判定為陽性。

2 結(jié)果

2.1 HIV-1核酸定量檢測試驗和WB檢測結(jié)果比較

對145例樣本分別進行WB和HIV-1核酸定量檢測試驗，WB檢出陽性樣本120例，陰性8例，結(jié)果不確定17例；核酸定量試驗檢出131例，結(jié)果為“TND”的14例。見表1。

2.2 病毒載量值的分布

131例HIV-1核酸定量試驗檢出樣本中，69例病毒載量log10值為4～5，所占比例為52.7%；log10值為3～4的樣本36份，所占比例27.5%；log10值大于5的樣本18份，所占比例為13.8%；log10值小于3的樣本8份，所占比例為6.0%。見表2。

2.3 WB不確定樣本及HIV-1核酸定量試驗和WB結(jié)果不一致樣本比較

表1 HIV-1核酸定量檢測試驗和WB檢測結(jié)果比較

表2 HIV-1核酸定量檢測結(jié)果分布

HIV-1核酸定量試驗檢出12例WB結(jié)果不確定樣本，2例WB陰性樣本；有3例WB結(jié)果為陽性的樣本，HIV-1核酸定量試驗結(jié)果為“TND”。見表3。

3 討論

多年來，由于體外HIV核酸擴增試驗操作步驟較復雜，受實驗室環(huán)境和操作者影響因素多，容易污染而導致假陽性，HIV-1核酸定量檢測大多用來評估HIV感染進程和監(jiān)測抗病毒療效，一般不作為診斷依據(jù)。《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》（2009年修訂版）中規(guī)定HIV核酸檢測只能作為輔助診斷依據(jù)，確診仍然需要HIV抗體確證試驗結(jié)果。隨著科技的發(fā)展，HIV-1核酸定量檢測技術(shù)有了很大的進展，自動化程度也日益提高，如Cobas AmpliPrep/Cobas Taq?Man全自動分析系統(tǒng)，核酸擴增和檢測程序全部在密閉的儀器中由機械臂進行自動化操作，完全代替了手工提取，大大降低了污染風險，使得檢測的精確度也大幅度提高。

從表1可看出，有117例樣本的WB和HIV-1核酸定量試驗結(jié)果一致，均為陽性。25例WB結(jié)果不確定和陰性樣本中，HIV-1核酸定量試驗檢出14例，其中10例病毒載量值＞104拷貝/mL（表2、3），符合HIV急性/早期病毒免疫學特征，可以判斷為HIV急性/早期感染；其余4例病毒載量值為612～2360拷貝/mL（表3），低于通常在急性/早期感染所見到的高病毒載量。由于本實驗使用的是實驗室?guī)齑鏄颖荆鄙倥R床和隨訪資料，無法得知樣本來源者的真實感染狀態(tài)及病毒治療相關(guān)信息，所以無從驗證HIV-1病毒載量對這幾例樣本的診斷結(jié)果。出現(xiàn)這種情況，可能是因為樣本采集于HIV感染病毒儲存庫建立初期，病毒載量值還處于較低水平；或者是由于樣本采集、保存和運輸不當?shù)仍蛟斐傻暮怂峤到猓灰膊荒芘懦菍嶒炇艺`操作、交叉污染等原因造成的假陽性結(jié)果。國外文獻曾報道病毒載量值較低的假陽性案例[3]，對于病毒載量值高于檢測限但小于5000拷貝/mL的樣本，通常視為可能存在假陽性結(jié)果[4-5]，建議再采集一份血漿進行HIV-1核酸定量檢測試驗。

表3 WB不確定樣本及WB和病毒載量試驗結(jié)果不符合樣本列表

有3例WB檢測結(jié)果為陽性的樣本，病毒載量檢測結(jié)果為“TND”（表3）。這是由于HIV-1核酸定量方法本身有最低檢測限（如COBAS AmpliPrep/CO?BAS TaqMan HIV-1 Test V2.0試劑盒的檢測下限為20拷貝/mL），檢測結(jié)果為“TND”只能代表未檢出。曾經(jīng)有報道，有少數(shù)未經(jīng)治療且抗體檢測陽性的感染者，血液中病毒含量長期處于低水平狀態(tài)，HIV-1核酸檢測試驗無法檢出[6-8]；檢測非B亞型時，HIV-1亞型變異導致的基因差異也可能出現(xiàn)檢測值被低估[9-12]的情況；此外，現(xiàn)有的HIV-1核酸定量檢測試劑無法檢測HIV-2的樣本。所以，對于HIV-1核酸定量檢測結(jié)果為“TND”的樣本，建議加做WB試驗或結(jié)合其他補充試驗結(jié)果來進行綜合診斷。

人體感染HIV后，首先在血液中檢出的是HIV RNA和p24抗原，急性期感染者血漿中病毒RNA急劇復制，最高可達107拷貝/mL[13]，HIV-1急性期感染者的傳染性明顯高于情況已穩(wěn)定的感染者，有研究顯示大約50%以上的HIV傳播發(fā)生在HIV感染急性早期階段[14]，所以HIV-1核酸定量試驗對于HIV急性/早期感染樣本的意義尤其重要。在本研究中，HIV-1核酸定量試驗比傳統(tǒng)的實驗室診斷（WB）方法有更高的敏感性，可以檢出由于急性/早期感染等原因?qū)е耊B試驗無法診斷的陽性樣本，彌補傳統(tǒng)WB診斷試驗的不足。

另外，HIV-1核酸定量試驗對于樣本質(zhì)量、實驗室環(huán)境和操作者的要求較高，HIV-1核酸定量試驗需要使用質(zhì)量較高的血漿，可能存在肝素的樣本，重度溶血、變質(zhì)、乳糜血、反復凍融樣本和由于溫度等原因造成的保存不當?shù)葮颖静贿m合用HIV-1核酸定量試驗進行檢測。在日常工作中，也要求我們要加強實驗室質(zhì)控，杜絕實驗室污染。

[1]中國疾病預防控制中心.全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范（2009年修訂版）[Z].2009.

[2]黑發(fā)欣,王璐.病毒載量檢測在HIV/AIDS抗體疑難樣本診斷中的應用[J].中國艾滋病性病,2010,16(3):323-326.

[3]Rich J S,Merriman N A,Mylonakis E,et al.Misdiagnosis of HIV infection by HIV-1 plasma viral load testing:a case se?ries[J].Ann Intern Med,1999,130:37-39.

[4]New York State Department of Heather AIDS Institute.Diag?nostic,monitoring,and resistance laboratory tests for HIV.Up?dated February 2011;section updates January 2014;section updates January 2014[E/OL].http://www.hivguidelines.org/wpcontent/uploads/2014/01/diagnostic-monitoring-and-resistancelaboratory-tests-for-hiv.pdf[2014-04-16].

[5]New York State Department of Heather AIDS Institute.Diagno?sis and management of acute HIV infection.Updated January 2010-Currently under Revision[E/OL].http://www.hivguidelines.org/wp-content/uploads/2012/10/diagnosis-and-management-ofacute-hiv-infection-10-16-2012.pdf[2014-04-16].

[6]Laperche S,Morel P,Deschaseaux M,et al.HIV antibody screening remains indispensable for ensuring viral safety of blood components despite NAT implementation[J].Transfusion,2003,43:1428-1432.

[7]Heffelfinger J,Delaney K,Owen M,et al.Ability of the gen?probe APTIMA HIV-1 RNA qualitative assay to confirm reac?tive rapid HIV screening tests[A]//Poster Session Presented at 16thConference on Retroviruses and Opportunistic Infections.2009:#993.

[8]Nugent C T,Nodelman V,Giachetti C,et al.Evaluation of a highly sensitive qualitative human immunodeficiency virus type1（HIV-1）RNA assay for detection fo HIV-1 suppression[J].J Clin Microbiol,2009,47(3):833-836.

[9]Lyles C M,Vlahov D.Comparison of two measures of human immunodeficiency virus（HIV）type 1 load in HIV risk groups[J].J Clin Microbiol,1998,12:3647-3652.

[10]Damond F,Roquebert B,Benard A,et al.Human immunodefi?ciency virus type 1（HIV-1）plasma load discrepancies be?tween the Roche COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Ver?sion 1.5 and the Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 assays[J].J Clin Microbiol,2007,45:3436-3438.

[11]Wolff D,Gerritzen A.Comparison of the Roche COBAS Am?plicorMonitor,Roche COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan and Abbott RealTime Test assays for quantification of hepati?tis C virus and HIV RNA[J].Clin Chem Lab Med,2007,45:917-922.

[12]Robertson K,Fiscus S.CSF,plasma viral load and HIV asso?ciated dementia[J].J Neuro,1998,4:90-94.

[13]Daar E S,Moudgil T,Mreye R D,et al.Transient high lev?els of viremia in patients with primary human immunodeficien?cy virus type 1 infection[J].N Engl J Med,1991,324(14):961-964.

[14]Priddy F H,Pilcher C D,Gupta P,et al.Detection of acute HIV infections in an urban HIV counseling and testing popu?lation in the United State[J].J Acquir Immune Defic Syndr,2007,44(2):196-202.