基于抗CD20單克隆抗體的2種夾心ELISA法的建立

鄧承蓮，董立厚，鄒佳，宋海峰

1.廣西醫科大學，廣西 南寧 530002；2.軍事醫學科學院 放射與輻射醫學研究所，軍事醫學科學院藥代動力學重點實驗室，北京 100850

分子靶向治療是近年來腫瘤治療領域的研究熱點，與傳統化療藥物相比，這類藥物具有靶向性、非細胞毒性、療效明顯等特點，主要對腫瘤細胞起調節和穩定作用[1-2]。作為治療B細胞淋巴瘤的靶向藥物，抗CD20單克隆抗體在治療性抗體中占有重要的一席之地，因此，其藥代動力學與毒代動力學研究也隨之成為一大熱點。

自1997年第一個抗CD20單克隆抗體利妥昔單抗（rituximab）獲準上市至今，該類藥物發展迅速，根據其不同的結構、人源化程度及Fc段修飾等，大致經歷了三代研發[3]。已報道的針對這類藥物的檢測分析方法主要為酶聯免疫吸附分析法（ELISA）[4-5]，另外也有流式細胞法[6-7]和Gyros法[8]等。本研究中，我們選用重組抗CD20人源化單克隆抗體（rh-anti-CD20zumab）作為目標藥物。該抗體是基于利妥昔單抗的結構經人源化改造而成，可通過與B細胞表面的CD20分子結合，經抗體依賴性細胞毒作用（an?tibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC）和補體依賴性細胞毒作用（complement dependent cyto?toxicity，CDC）等途徑發揮抗腫瘤作用[9-10]。針對該抗體，我們建立了2種不同的夾心ELISA法用于定量檢測生物基質中rh-anti-CD20zumab的濃度，并對其方法學進行較為全面驗證，試圖為后續的rh-anti-CD20zumab在食蟹猴體內的藥代動力學研究提供不同的分析方法。

本研究中采用不同的分析方法進行藥代動力學研究，得到的結果可以相互印證，從而可提高分析方法的準確性。同時，我們對2種方法進行了比較，為類似治療性抗體的臨床前藥代動力學研究提供了不同的研究路線，不同實驗室可根據自身試劑的獲取難易程度而選擇不同的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

rh-anti-CD20zumab（批號：20121101，純度＞98%，上海醫藥集團有限公司）；山羊抗人IgG F(ab')2抗體（批號：104172，Jackson ImmunoResearch公司）；驢抗人IgG Fc抗體（批號：105065，Jackson Im?munoResearch公司）；HRP標記的猴血清吸附的山羊抗人IgG多克隆抗體（批號：A80-319P-15，Bethyl公司）；小鼠IgG（批號：ab37355，Abcam公司）。

96孔酶標板（Nunc公司）；微量加樣器（Brand公司）；洗板機（Thermo公司，型號為4MK2）；酶標儀（Thermo公司，型號為MK3）。

1.2 捕獲抗體為山羊抗人IgG F（ab'）2抗體的夾心ELISA法

①包被：用山羊抗人IgG F（ab'）2抗體包被酶標板，100 μL/孔，4℃靜置過夜后用洗板液洗板3次；②封閉：以1%I-Block為封閉液，300 μL/孔封閉反應2.5 h，用洗板液洗板3次；③加樣：用100%食蟹猴空白血漿將rh-anti-CD20zumab標準品梯度稀釋至10 000～20 ng/mL，另用同樣方法單獨配制濃度為3750、1500、100 ng/mL的質控樣品；用稀釋液（PBS緩沖液加0.5%Tween-20和1 mol/L NaCl）對所有血漿樣品進行1∶20前處理，每個前處理后的樣品以100 μL/孔加入酶標板中，每個樣品設2個復孔，室溫孵育2.5 h，用洗板液洗板3次；④加酶標二抗：加入25 ng/mL HRP標記的猴血清吸附的山羊抗人IgG抗體，室溫孵育55 min，用洗板液洗板6次；⑤顯色與測定：加入TMB避光顯色15 min，1 mol/L硫酸終止顯色，酶標儀比色讀取D450nm值。

1.3 捕獲抗體為驢抗人IgG Fc抗體的夾心ELISA法

①包被：用驢抗人IgG Fc抗體包被酶標板，100 μL/孔，4℃靜置過夜后用洗板液洗板3次；②封閉：以 1%I-Block為封閉液，300 μL/孔，封閉反應3 h，用洗板液洗板3次；③加樣：用100%食蟹猴空白血漿將rh-anti-CD20zumab標準品梯度稀釋至25 000～20 ng/mL，另用同樣方法單獨配制濃度為10 000、4000、110 ng/mL的質控樣品；用稀釋液（同上）對所有血漿樣品進行1∶10前處理，每個前處理后的樣品以100 μL/孔加入酶標板中，每個樣品設2個復孔，室溫孵育3 h，用洗板液洗板3次；④加酶標二抗：加入30 ng/mL猴血清吸附HRP標記的山羊抗人IgG抗體，室溫孵育55 min，用洗板液洗板6次；⑤顯色與測定：加入TMB避光顯色15 min，1 mol/L硫酸終止顯色，酶標儀比色讀取D450nm值。

2 結果

2.1 特異性

考察結構類似物小鼠IgG對2種方法的干擾情況。按照制備標準曲線的方法制成高濃度質控樣品和低濃度質控樣品，并使其中含有10倍或1倍定量上限（ULOQ）濃度的小鼠IgG。捕獲抗體為山羊抗人IgG F（ab'）2的夾心ELISA法中，在高、低質控樣品中均分別加入50 000和5000 ng/mL的小鼠IgG后，rh-anti-CD20zumab的平均分析回收率（%AR）分別為122.5%和122.1%、107.6%和107.1%。捕獲抗體為驢抗人IgG Fc抗體的夾心ELISA法中，在高、低質控樣品中均分別加入250 000和25 000 ng/mL的小鼠IgG后，rh-anti-CD20zumab的平均分析回收率分別為114.4%和106.9%、81.5%和81.5%。這表明在獼猴血漿中存在50 000 ng/mL（包被抗體為山羊抗人IgG F（ab'）2抗體）和125 000 ng/mL（包被抗體為驢抗人IgG Fc抗體）的小鼠IgG時，均不會影響待測抗體的準確性，但后者優于前者。

2.2 標準曲線和線性范圍

用100%食蟹猴血漿配制標準曲線，批間重復5次。標準曲線采用相同濃度下各批回算平均值之間的變異系數（CV）和相對誤差（RE）來評價。結果見圖1。2種方法的CV分別小于7.3%和11.1%，RE分別為-16.5%～13.2%和-4.4%～3.9%，均滿足生物技術藥物的藥代動力學要求，標準曲線均具有良好的線性和重現性。2種方法的線性范圍分別為40～5000和40～12 500 ng/mL，具有相同的靈敏度，但捕獲抗體為山羊抗人IgG Fc抗體的夾心ELISA法的線性范圍更寬。

2.3 準確度和精密度

不同實驗日期進行5批樣品驗證，結果見表1。捕獲抗體為山羊抗人IgG F（ab'）2抗體的夾心ELISA法中，各級別驗證樣品的準確度RE為-10.3%～16.6%，板內和板間精密度CV≤16.2%；捕獲抗體為驢抗人IgG Fc抗體的夾心ELISA法中，各級別驗證樣品的準確度RE為-14.4%～12.9%，板內和板間精密度CV≤19.4%，均符合方法學確證要求，兩者相近。

2.4 稀釋線性和鉤狀效應

考察樣品稀釋對樣品濃度檢測準確度的影響。捕獲抗體為山羊抗人IgG F（ab'）2抗體的夾心ELISA法中，根據實驗需要分別用100%食蟹猴空白血漿配制濃度分別為250 000、25 000、6000 ng/mL的樣品溶液，考察稀釋率為1/1000、1/500、1/50、1/5和1/2的稀釋效應；捕獲抗體為驢抗人IgG Fc抗體的夾心ELISA法中，根據實驗需要分別用100%食蟹猴空白血漿配制濃度分別為200 000、20 000、8000 ng/mL的樣品溶液，考察稀釋率為1/500、1/100、1/50、1/5、1/2的稀釋效應。結果見表2。將已知濃度的rh-anti-CD20zumab標準品稀釋至不同濃度，2種方法的RE分別小于18.6%和13.3%，均符合方法學確證要求，但后者優于前者。

考察2種方法是否具有鉤狀效應。捕獲抗體為山羊抗人IgG F（ab'）2抗體的夾心ELISA法中，考察3 000 000、300 000、30 000、3000、300 ng/mL濃度點，結果表明D450nm值隨著樣品濃度的增加而增加，在3 000 000～300 ng/mL范圍內沒有出現鉤狀效應；捕獲抗體為驢抗人IgG Fc抗體的夾心ELISA法中，考察 3 000 000、300 000、30 000、6000、1200 ng/mL濃度點，結果表明D450nm值隨著樣品濃度的增加而增加，在3 000 000～1200 ng/mL范圍內沒有出現鉤狀效應。

3 討論

圖1 2種ELISA法測定的標準曲線（n=5）

表1 2種ELISA法的精密度和準確度（n=5）

免疫學分析方法包括ELISA、放射免疫測定（RIA）和熒光免疫分析（IFA）等，其中ELISA為公認的較為快捷靈敏的方法[4]。本研究中，我們以重組抗CD20人源化單克隆抗體作為待測物，分別選用抗人IgG F（ab'）2抗體和抗人IgG Fc抗體作為捕獲抗體，建立了2種靈敏高效的夾心ELISA法，試圖為后續rh-anti-CD20zumab在食蟹猴體內的藥代動力學研究提供不同的分析方法。其中，捕獲抗體為抗人IgG F（ab'）2抗體的雙抗體夾心ELISA法中，捕獲抗體針對的是rh-anti-CD20zumab 的 F（ab'）2段；捕獲抗體為抗人IgG Fc抗體的雙抗體夾心ELISA法中，捕獲抗體針對的是rh-anti-CD20zumab的Fc段。結果表明，對于配制在全血漿基質中的藥物而言，這2種分析方法的靈敏度、精密度、準確度、特異性、稀釋線性等各項驗證指標均符合藥代動力學研究的要求。雖然兩者的靈敏度、精密度和準確度相同或相近，但后者的線性范圍更寬，并且稀釋線性和特異性更好。整體來說，后者優于前者，2種分析方法均可用于rh-anti-CD20zumab的臨床前藥代動力學研究，并且也為其他類似抗體的藥代動力學研究提供了2條合適的研究路線。

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